基于BiOI納米片雙識別型毒死蜱光電化學(xué)傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用研究

金黨琴，龔愛琴，王元有，雍達(dá)明，孫 強(qiáng)，朱文軍，孫艷艷

（揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

毒死蜱（CPF）是一種高效中毒有機(jī)磷農(nóng)藥，可破壞害蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性［1］，對植食性害蟲，如飛虱、稻縱卷葉螟、菜青蟲等具有很好的毒殺效果［2］，在蔬菜、水果、糧食作物中應(yīng)用十分廣泛。但因過量使用，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響了生態(tài)環(huán)境安全，對人與動物的生命安全構(gòu)成威脅［3－4］。聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（UNEP）和糧農(nóng)組織（FAO）禁用或嚴(yán)格限制一些高毒有機(jī)磷農(nóng)藥（如甲基對硫磷和對硫磷）在農(nóng)業(yè)上使用［4］。泰國政府規(guī)定針對百草枯和毒死蜱從2020年6月1日起實(shí)施禁令［5］。日本肯定列表制度中明確毒死蜱在蔬菜中的最高殘留限量為0．01～0．5 mg/kg，我國規(guī)定無公害蔬菜中的毒死蜱最高殘留限量為1 mg/kg［6－7］。

毒死蜱殘留檢測的方法有氣相色譜（GC）［8］和氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）［9］、液相色譜（LC）［10］和液相色譜－質(zhì)譜法（LC－MS）［11］、表面增強(qiáng)拉曼光譜法（SERS）［12］等，但這些方法常要求復(fù)雜的前處理、成本昂貴，且不適合現(xiàn)場檢測。光電化學(xué)（PEC）技術(shù)因其具有成本低、靈敏度高、儀器簡單、易于小型化等特點(diǎn)而得到快速發(fā)展［13－16］。在光照射下，PEC傳感器產(chǎn)生的光電流強(qiáng)度與分析物的濃度成正比，可用于定量分析。光敏材料和選擇性是決定PEC傳感器敏感性的兩個(gè)關(guān)鍵因素。

作為一種新型三元氧化物半導(dǎo)體，碘氧化鉍（BiOI）因具有獨(dú)特的分層結(jié)構(gòu)，內(nèi)部靜電場垂直于每一層，可以引起光生電子和空穴有效分離，被認(rèn)為是光捕獲材料［17］。其中，由于最小帶隙（～1．8 eV）和強(qiáng)吸收可見光特性（吸收邊緣為～680 nm），Bi OI在太陽光照射下表現(xiàn)出優(yōu)異的光吸收性能，已成為研究熱點(diǎn)［18］，可作為光電化學(xué)傳感器的電極修飾材料。生物酶分子印跡光電化學(xué)傳感器因具有高選擇性優(yōu)點(diǎn)，對其研究可進(jìn)一步提高光電化學(xué)傳感器的選擇性［19］。本研究利用分子印跡聚合物對目標(biāo)分子毒死蜱的選擇性識別能力降低樣品基質(zhì)干擾，并利用毒死蜱對AChE活性的抑制原理，構(gòu)建了分子印跡AChE/Bi OINFs/ITO雙識別型光電化學(xué)傳感器，為水樣中毒死蜱的痕量檢測提供了一種新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），氘鹵鎢燈光源裝置（250 W，λ=504～624 nm，北京紐比特科技有限公司），光源對著電解池中導(dǎo)電玻璃修飾面進(jìn)行光照射；Hitachi S－4800掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司），加速電壓15 kV進(jìn)行掃描；所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下采用傳統(tǒng)的三電極體系，參比電極是飽和甘汞電極（SCE），輔助電極是鉑絲（φ=1．0 mm），工作電極是氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電玻璃（深圳市力科光電玻璃有限公司）。

氯化乙酰硫代膽堿（ATCl，99%）、AChE（C3389，500 U/mg）購自Sigma－Aldrich公司；毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL，乙腈溶解）、Bi（NO3）3·5H2O、KI、2-氨基對苯二甲酸（H2BDC－NH2）、二甲基甲酰胺（DMF）、對巰基苯胺（ATP）、戊二醛、KCl、甲醇（分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）。0．1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）用NaH2PO4和Na2HPO4配制。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 MIP/BiOINFs/ITO與MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極的制備

用玻璃刀將氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電玻璃切成長×寬為5 cm×0．6 cm長方形小片，置于2 mol/L KOH的異丙醇溶液煮沸保持30 min，取出，超聲清洗10 min，放入100℃烘箱中烘干，備用。

BiOINFs/ITO電極的制備［20］：通過連續(xù)的離子層吸附和反應(yīng)（SILAR）法制得BiOI納米片組（BiOINFs），取2個(gè)燒杯用水分別配制5 mmol/L Bi（NO3）3·5H2O和5 mmol/L KI溶液。處理后的ITO浸入Bi（NO3）3溶液中，取出用水沖洗，然后再浸入KI溶液，每一個(gè)浸入過程持續(xù)10 s，經(jīng)過一定的SILAR循環(huán)后，制得BiOINFs/ITO在室溫下自然晾干。

MIP/BiOINFs/ITO電極的制備：將上述BiOINFs/ITO電極放入含有5 mmol/L對巰基苯胺和0．1 mmol/L毒死蜱的pH 7．0 PBS中，電位值為－1．5 V，恒電位沉積聚合5 min，毒死蜱被聚合到電極表面，取出電極，用適量0．1%戊二醛滴涂至電極表面，自然晾干，用水沖洗過量的戊二醛，再晾干，制得修飾電極。將修飾電極浸入0．1 mol/L KCl溶液中，循環(huán)伏安掃描30圈洗脫掉模板分子，電位范圍為－1．2~0．5 V，取出電極，自然晾干，制得毒死蜱分子印跡傳感器（MIP/BiOINFs/ITO），其表面留有許多毒死蜱分子識別位點(diǎn)。

MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極的制備：將制得的MIP/BiOINFs/ITO浸入含6 mU/mL AChE的5 mmol/LPBS（pH 7．0）溶液中6 h。取出，用PBS沖洗MIP/BiOINFs/ITO電極表面未固定的AChE，沖洗時(shí)間持續(xù)15 min，制得MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極。

1.3 毒死蜱的分子印跡光電化學(xué)測定

取5 mL 0．1 mol/L PBS（pH 7．0），向緩沖溶液中加入一定濃度的毒死蜱，將制得的MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極浸入其中，保持10 min，取出后，再將此電極插入含1．0 mmol/L ATCl的0．1 mol/L PBS（pH 7．0）中，測試光電化學(xué)反應(yīng)。采用I－t法，20 s進(jìn)行光照，持續(xù)10 s，30 s時(shí)關(guān)閉光源。偏置電壓：0 V。毒死蜱的抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=( )I0-I/I0×100，式中，I0和I分別表示不存在和存在毒死蜱時(shí)，MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極對ATCl的光電流值。

2 結(jié)果與討論

2.1 BiOINFs/AChE的表征

采用掃描電子顯微鏡對制備的BiOINFs納米材料形貌進(jìn)行表征（如圖1）。從圖1A中可以看出，通過SILAR法制得的BiOINFs納米片均勻地分布在ITO基體上。圖1B顯示BiOINFs/ITO電極表面被毒死蜱分子印跡后，BiOINFs納米片的多孔結(jié)構(gòu)無變化。通常，多孔納米結(jié)構(gòu)基底利于蛋白質(zhì)的固定，直接影響生物傳感器的最終性能。因此，BiOINFs的這種交錯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更有利于生物酶分子的固定。隨著AChE的固定化，發(fā)現(xiàn)AChE-BiOINFs的形態(tài)（圖1C）與BiOINFs相似，表明BiOI的結(jié)構(gòu)形態(tài)固定后保持不變。

圖1 BiOINFs/ITO（A）、MIP/BiOINFs/ITO（B）及MIP/AChE/BiOINFs/ITO（C）的SEM圖Fig．1 SEM images of BiOINFs/ITO（A），MIP/BiOINFs/ITO（B）and MIP/AChE/BiOINFs/ITO（C）

在含有2．0×10–3mol/L［Fe（CN）6］3－/4－的0．1 mol/L KCl溶液中，進(jìn)一步通過電化學(xué)阻抗譜法（EIS）研究分子印跡光電化學(xué)傳感器的逐步組裝過程（如圖2）。結(jié)果顯示，BiOINFs/ITO的交流阻抗最小（圖2a），通過電聚合法制備分子印跡聚合膜后，交流阻抗顯著增加（圖2b），這可能是因?yàn)榉肿佑≯E聚合膜增加了傳質(zhì)阻力的緣故。當(dāng)AChE修飾到MIP/BiOINFs/ITO電極表面后，交流阻抗進(jìn)一步增加（圖2c），表明AChE的不導(dǎo)電特性會阻礙電子傳遞和電化學(xué)探針的大量傳輸，導(dǎo)致阻抗增強(qiáng)。上述研究結(jié)果表明基于AChE分子印跡電極修飾的每一步過程都是成功的。

圖2 不同電極在2．0×10–3 mol/L［Fe（CN）6］3?/4?溶液中的交流阻抗圖Fig．2 Electrochemical impedance spectroscopy of differ?ent electrodes in 2．0×10－3 mol/L［Fe（CN）6］3－/4－a：BiOINFs/ITO；b：MIP/BiOINFs/ITO；c：MIP/AChE/BiO?INFs/ITO；0．1 mol/L KCl

2.2 不同修飾電極的光電流實(shí)驗(yàn)

為了研究可見光誘導(dǎo)產(chǎn)生光電流響應(yīng)情況，對3種修飾電極（Bi OINFs/ITO、MIP/BiOINFs/ITO、MIP/AChE/BiOINFs/ITO）在0．1 mol/L PBS（pH 7．0）中的光電流響應(yīng)情況進(jìn)行考察（見圖3A）。結(jié)果表明，在可見光照射下，BiOINFs/ITO產(chǎn)生明顯的光電流（曲線a）；由于分子印跡產(chǎn)生的印跡空穴利于電子傳遞，MIP/BiOINFs/ITO的光電流（曲線b）大于Bi OINFs/ITO；MIP/AChE/BiOINFs/ITO（曲線c）的光電流略高于MIP/BiOINFs/ITO。在PBS溶液中加入酶底物ATCl后，MIP/AChE/BiOINFs/ITO（曲線e）的光電流為42．6 nA，為不含ATCl情況下MIP/AChE/BiOINFs/ITO光電流（11．8 nA）的3．6倍。表明酶底物的加入導(dǎo)致光電流顯著提升，可以解釋為：當(dāng)PBS溶液中加入酶底物ATCl，固定的AChE可以催化ATCl水解為乙酸鹽和硫代膽堿，在可見光照射下，硫代膽堿易捕獲光生空穴，發(fā)生氧化反應(yīng)，促進(jìn)光生電子和光生空穴分離，導(dǎo)致光電流強(qiáng)度增強(qiáng)。同樣實(shí)驗(yàn)條件下，未修飾AChE的MIP/BiOINFs/ITO的光電流未見明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步說明BiOINFs提供了良好的固定AChE的基質(zhì)，且AChE保留了其生物活性。

MIP/AChE/BiOINFs/ITO在不同濃度毒死蜱溶液中浸入10 min后，再放入含有酶底物ATCl的PBS中，考察其光電流響應(yīng)情況（見圖3B）。結(jié)果表明，MIP/AChE/BiOINFs/ITO的光電流隨著毒死蜱濃度的增加（0~20．0 nmol/L）而降低（曲線a~d），且光電流的降低量與毒死蜱濃度成正比。因此，該分子印跡生物傳感器可用于毒死蜱的檢測。

圖3 A：BiOINFs/ITO（a），MIP/Bi OINFs/ITO（b），MIP/AChE/BiOINFs/ITO（c）在0．1 mol/L pH 7．0 PBS中，以及MIP/BiO?INFs/ITO（d），MIP/AChE/Bi OINFs/ITO（e）在含1．0 mmol/L ATCl的0．1 mol/L pH 7．0 PBS中的光電流響應(yīng)；B：MIP/AChE/BiOINFs/ITO在不同濃度毒死蜱溶液中浸入10 min后，在含1．0 mmol/L ATCl溶液的0．1 mol/L pH 7．0 PBS中的光電流響應(yīng)Fig．3（A）Photocurrent responses of BiOINFs/ITO（a），MIP/BiOINFs/ITO（b）and MIP/AChE/Bi OINFs/ITO（c）in 0．1 mol/LpH 7．0 PBS，and MIP/Bi OINFs/ITO（d），MIP/AChE/Bi OINFs/ITO（e）in 0．1 mol/L pH 7．0 PBS containing 1．0 mmol/LATCl；（B）photocurrent responses of MIP/AChE/BiOINFs/ITO in PBS containing 1．0 mmol/LATCl after immersion in different concentrations chlorpyrifos solution for 10 minB：concentration of chlorpyrifos（a－d）：0，0．5，1．0，20．0 nmol/L

2.3 ATCl濃度的優(yōu)化

ATCl濃度是毒死蜱分析的重要參數(shù)之一，當(dāng)其濃度過低時(shí)，MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極產(chǎn)生的光電流很小，很難檢出毒死蜱含量。然而，ATCl濃度過高時(shí)會導(dǎo)致AChE的活性中心被底物占據(jù)，不利于抑制劑的抑制。實(shí)驗(yàn)考察了6種不同ATCl濃度（0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2 mmol/L）對電極光電流的影響。結(jié)果顯示，隨著ATCl濃度的增大，體系的光電流強(qiáng)度增強(qiáng)，且在1．0 mmol/L ATCl時(shí)達(dá)到最高。繼續(xù)增大ATCl濃度，則光電流強(qiáng)度降低（見圖4A）。因此，實(shí)驗(yàn)選擇1．0 mmol/L的ATCl為最佳濃度。

2.4 p H值的優(yōu)化

溶液pH值影響AChE的生物活性，為此考察了不同pH值對MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極光電流的影響。為了保持BiOINFs的穩(wěn)定性［17］，溶液pH從6．0~10．0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)溶液pH值為7．0時(shí)，電極的光電流最大（見圖4B）。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳pH值為7．0。

圖4 不同濃度ATCl（A）及溶液pH值（B）對MIP/AChE/Bi OINFs/ITO光電流的影響Fig．4 Influences of different ATCl concentrations（A）and pH values（B）on photocurrents of MIP/AChE/BiOINFs/ITO

2.5 MIP/AChE/BiOINFs/ITO光電化學(xué)檢測毒死蜱

在PBS溶液中，將MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極分別浸入不同濃度（0、0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、20．0、50．0、100．0、200．0 nmol/L）毒死蜱中10 min后，進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，電極的光電流值隨著毒死蜱濃度的增加而降低，且光電流抑制率和毒死蜱濃度（CCPF）在0．02～1．0 nmol/L和20．0～200．0 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為：抑制率（%）=49．253CCPF+9．433（r2=0．998 6）和抑制率（%）=0．193CCPF+57．599（r2=0．999 1），信噪比（S/N）為3時(shí)，檢出限為0．005 nmol/L。相比于GC［6］、GC－MS［7］、HPLC［9］、HPLC－MS［10］、SERS［11］和分子印跡光電化學(xué)傳感器［1］等方法，本方法的靈敏度更高（見表1），且本方法的檢出限低于我國規(guī)定的毒死蜱最高殘留限量。因此，該方法適用于實(shí)際樣品中毒死蜱的檢測。

表1 對毒死蜱不同分析方法的比較Table 1 Comparison of the analytical performance of different methods for chlorpyrifos detection

2.6 方法的重現(xiàn)性、再現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用相同MIP/AChE/BiOINFs/ITO修飾電極重復(fù)測量0．5 nmol/L毒死蜱9次，測得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4．2%，表明所制備的電極具有較好的重現(xiàn)性。用相同批次9個(gè)MIP/AChE/BiOINFs/ITO修飾電極分別測定0．5 nmol/L毒死蜱，測定結(jié)果的RSD為3．9%，表明修飾電極具有良好的再現(xiàn)性。進(jìn)一步對MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。將該分子印跡電極在4℃下儲存7 d后，通過測定，其光電流保留了原光電流響應(yīng)值的93．9%，說明該雙識別型傳感器的穩(wěn)定性較好。

2.7 方法的選擇性及其在實(shí)際樣品中的應(yīng)用

在優(yōu)化條件下，選擇一些和毒死蜱結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，如：三唑磷（TRI）、氯苯（CHL）、殺螟硫磷（FEN）和甲基對硫磷（MP）作為干擾物，考察了分子印跡傳感器對毒死蜱的選擇性。通過在0．2 nmol/L毒死蜱中加入2．0 nmol/L TRI、CHL、FEN、MP，共存條件下測量光電流信號的強(qiáng)度。結(jié)果表明，當(dāng)毒死蜱中添加上述干擾物時(shí)，其光電流信號分別為34．7、34．9、35．1、34．8 nA，相比較僅含毒死蜱（35．0 nA）時(shí)無明顯變化，表明該分子印跡傳感器的選擇性較好，具有一定的抗干擾能力。

在優(yōu)化條件下，采用制備的MIP/AChE/BiOINFs/ITO測定地表水樣品中的毒死蜱含量，結(jié)果未檢出毒死蜱，進(jìn)一步對樣品進(jìn)行不同濃度（0．05、0．1、0．5、1．0、20．0 nmol/L）毒死蜱的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明水樣中毒死蜱的回收率為96．1%～108%，RSD為2．8%～4．2%。表明傳感器在復(fù)雜樣品中具有良好的準(zhǔn)確度和回收率。

3 結(jié) 論

鑒于分子印跡技術(shù)和酶的良好選擇性以及BiOINFs在太陽光照射下優(yōu)異的光吸收性能，本文構(gòu)建了一種基于BiOINFs納米材料制備雙識別型光電化學(xué)傳感器，光電子在毒死蜱、BiOINFs和ITO之間的快速傳遞，使得光電流顯著增強(qiáng)。分子印跡技術(shù)和生物酶AChE的固定進(jìn)一步增強(qiáng)了該傳感器的選擇性。該傳感器靈敏度高、制作簡便、便于攜帶，為水樣中毒死蜱的檢測提供了一種簡便的方法。