基于fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的去氧腎上腺素電化學發(fā)光傳感器的構建和應用

韋富存，歐盼盼，吳葉宇，吳佳雯，林 瑜，杜方凱，譚學才

（廣西民族大學 化學化工學院，林產(chǎn)化學與工程國家民委重點實驗室，廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室，廣西林產(chǎn)化學與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西高校食品安全與藥物分析化學重點實驗室，廣西 南寧 530008）

去氧腎上腺素（PHE）是一種重要的擬腎上腺素藥物，具有收縮血管并增加血壓的效果［1］，在醫(yī)學中通常用作血管加壓藥物，用于治療休克和維持麻醉狀態(tài)下血壓的穩(wěn)定，也用于緩解法洛四聯(lián)癥和陣發(fā)性室上性心動過速的發(fā)作［2］。醫(yī)學研究表明，PHE的過量使用易導致人體出現(xiàn)胸痛、呼吸困難、心率異常、震顫或昏厥，甚至危及生命等不良反應［3］。因此，對此類藥物進行嚴格的質(zhì)量檢測在臨床治療和藥品質(zhì)量監(jiān)控中均具有重大的現(xiàn)實意義。目前，PHE的測定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［4－5］、伏安法（CV）［6］和熒光法（FL）［7－9］。但這些方法的檢測時間較長，往往需要復雜的樣品前處理，相比之下，電化學發(fā)光法（ECL）因操作簡單、成本低廉、檢測速度快、靈敏度高和儀器簡單等優(yōu)點而備受關注［10］。然而，目前ECL技術在PHE類藥物分析中的應用相對較少，因此，開發(fā)一種簡單、高效和便捷的ECL方法用于檢測藥物中的PHE具有重要的現(xiàn)實意義。

Ru（bpy）2+3摻雜的二氧化硅納米粒子（RuSi NPs）作為經(jīng)典的電化學發(fā)光體，在ECL傳感器中發(fā)揮著重要的作用，然而二氧化硅的導電惰性容易導致RuSi NPs的ECL發(fā)光效率降低和靈敏度變差，極大地限制了其在ECL傳感器中的應用。目前多種具有大比表面積和良好導電性能的材料已被用于改善RuSi NPs的ECL性能，例如Wang等［11］制備了Ru（bpy）2+3摻雜的Au－SiO2核殼納米復合材料（Au@SiO2－Ru），并用作ECL傳感器的發(fā)光體和信號放大元件；張慧等［12］基于3D石墨烯/SiO2@Ru（bpy）2+3復合材料構建了敵草隆的電化學發(fā)光傳感器；Chen等［13］將羧基化多壁碳納米管（CMWCNTs）與Ru（bpy）2+3摻雜的二氧化硅納米球混合制成薄膜，并修飾于玻碳電極的表面，具有優(yōu)良導電性和大比表面積的CMWCNTs有效提高了復合薄膜的導電性，并顯著地提高了Ru（bpy）2+3的ECL信號。然而，目前尚無文獻報道關于二氧化鈦和RuSi NPs復合物在ECL傳感器中的應用。

花狀二氧化鈦是一種重要的半導體材料，其表面呈現(xiàn)三維的花瓣狀結構，因而比其他形貌二氧化鈦（如量子點、球狀、管狀、多孔狀等）有著更大的比表面積，而且其表面富含羥基，容易進行功能化修飾，因此受到人們的普遍關注［14］。然而，由于用于合成二氧化鈦的鈦源試劑（如鈦酸四丁酯、四異丙醇鈦和四氟化鈦等）具有高的反應活性，易在空氣中發(fā)生水解而導致合成的二氧化鈦出現(xiàn)嚴重團聚的現(xiàn)象，因此極大地限制了其在ECL傳感器中的應用。鉑納米粒子（Pt NPs）作為一種重要的催化劑，已被證明是魯米諾（Luminol）［15］、紅熒烯［16－17］、石墨相碳化氮等多種ECL發(fā)光試劑的敏化劑。然而由于Pt NPs的顆粒較小，單個Pt NPs的催化作用有限且不穩(wěn)定，通常需要將其負載于特殊的基底表面以提高其催化活性。

本研究采用溶劑熱法制備了一種高度有序的花狀分級二氧化鈦微/納米顆粒（fl-TiO2），將其負載于Pt NPs和RuSi NPs，構建了一種基于fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的新型固態(tài)ECL傳感器。Pt NPs優(yōu)異的電催化活性顯著提高了RuSi NPs－三丙胺（TPrA）體系的ECL信號強度，fl-TiO2的巨大比表面積則為Pt NPs和RuSi NPs提供了豐富的結合位點，因此，fl-TiO2/Pt NPs復合物可充當新型的ECL信號放大器，以顯著提高RuSi NPs－TPrA體系的ECL發(fā)射效率。最后，基于PHE對該傳感器的ECL響應信號有強烈的抑制作用，成功地將該傳感器用于藥物中PHE的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI－EⅡ型電致化學發(fā)光檢測系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限公司）；PGSTAT 128N型電化學工作站（瑞士萬通中國有限公司）；SUPRA 55 Sapphire場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；D8 ADVANCE X射線粉末衍射儀（德國布魯克AXS公司）；日立F－4600型熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；Agilent Cary 60紫外可見分光光度計（美國安捷倫有限公司）。

鈦酸四丁酯（TBT）、油酸、曲拉通X-100（TX－100）、六水合氯鉑酸、環(huán)己烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、正丁醇、硅酸四乙酯（TEOS）、檸檬酸三鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三丙胺（TPrA）、濃氨水（25%～28%）、Ru（bpy）3Cl2·6H2O（上海麥克林生化科技有限公司）；濃鹽酸（36．5%，西隴科學股份有限公司）；鹽酸去氧腎上腺素（PHE，索萊寶生物科技有限公司）；鹽酸去氧腎上腺素注射液（1 mL，10 mg，上海禾豐制藥有限公司），所用試劑均為分析純，實驗用水為密理博超純水系統(tǒng)凈化的超純水。

1.2 實驗條件

示差脈沖伏安（DPV）、交流阻抗（EIS）和ECL測試均采用三電極體系：fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE為工作電極，Ag/AgCl（0．3 mol/L KCl）電極為參比電極，Pt柱電極為輔助電極。DPV測試條件：掃描電位為－0．2～0．6 V，掃描速率為0．1 V/s，電解質(zhì)溶液為10 mL含有0．1 mol/L KCl和5．0×10－3mol/L K3［Fe（CN）6］的混合溶液。EIS測試條件：頻率范圍為0．01～100 000 Hz，振幅為0．01 V，測試電位為開路電位，電解質(zhì)溶液為10 mL含有0．1 mol/L KCl、5．0×10－3mol/L K3［Fe（CN）6］和5．0×10－3mol/L K4［Fe（CN）6］的混合溶液。ECL測試條件：光電倍增管（PMT）的電壓為600 V，掃描電位為0～1．25 V，掃描速率為0．2 V/s，電解質(zhì)溶液為含有2．0×10－3mol/L TPrA的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0．1 mol/L）。

1.3 fl-TiO 2/Pt NPs/RuSi NPs復合材料的制備

參照文獻制備RuSi NPs［21］：將1．77 mL TX－100、7．5 mL環(huán)己烷、1．8 mL正己醇和340μL Ru（bpy）2+3溶液（40×10－3mol/L）混合攪拌0．5 h，然后加入100 mL TEOS和60μL濃氨水，在室溫下繼續(xù)反應24 h，用丙酮破乳沉降，離心收集固體物并依次用無水乙醇和水各洗滌3次，冷凍干燥，得到橙黃色的RuSi NPs。

參照文獻制備fl-TiO2［22］：在攪拌下將2 mL濃鹽酸、20 mL油酸和4 mL TBT混合均勻后，轉(zhuǎn)移至50 mL Teflon內(nèi)襯中，在180℃下反應12 h，離心收集產(chǎn)物并用無水乙醇洗滌數(shù)次，在60℃下干燥處理，然后在500℃下退火1 h，得到純白色的fl-TiO2。

Pt NPs的制備方法與文獻一致［15］：在劇烈攪拌下，將0．5 mL檸檬酸三鈉溶液（3 mol/L）快速注入50 mL沸騰的H2PtCl6溶液（1．0%）中并保持攪拌0．5 h，得到黑褐色的Pt NPs溶液。

fl-TiO2/Pt NPs的制備：在攪拌下將400μL APTES溶液加入2 mL fl-TiO2的無水乙醇分散液（10 mg/mL）中，在室溫下反應6 h，離心收集固體物，經(jīng)無水乙醇洗滌數(shù)次，得到氨基功能化的fl-TiO2，然后分散于10 mL Pt NPs溶液中，在室溫下攪拌12 h，產(chǎn)物經(jīng)離心和水洗滌數(shù)次后，重新分散于10 mL水中，得到fl-TiO2/Pt NPs的懸浮液。

fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的制備：將不同體積（2、4、6、8、10 mL）的fl-TiO2/Pt NPs懸浮液與12 mg RuSi NPs混合均勻，加水定容至10 mL，超聲分散均勻后得到fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的懸浮溶液。

1.4 傳感器的制備

依次用粒徑分別為1．0、0．3、0．05μm的α-Al2O3粉末將玻碳電極（GCE）進行拋光處理，然后將4μL的fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs懸浮液涂覆于GCE的表面，自然晾干后，制成fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE傳感器。fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE傳感器的構建過程和檢測機理如圖1所示。

圖1 fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs復合材料的制備過程（A）和傳感器的檢測機理（B）Fig．1 The preparation process of fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs（A）and its probable mechanism for PHEdetection（B）

2 結果與討論

2.1 材料的表征

采用掃描電鏡（SEM）分別對fl-TiO2、Pt NPs、fl-TiO2/Pt NPs、RuSi NPs和fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs共5種合成材料的形貌進行表征。其中，fl-TiO2呈大小均勻、粒徑約為5μm的球狀顆粒（圖2A），其表面是由大量的長方體狀晶體由球心向外有序組裝而成的花瓣狀分級結構（圖2B）。fl-TiO2/Pt NPs（圖2C）中可明顯觀察到有大量Pt NPs附于fl-TiO2的表面，結合Pt NPs的SEM圖（圖2D）可知，Pt NPs與fl-TiO2復合后，原本聚集的Pt NPs均勻地分布在fl-TiO的表面。fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs（圖2E）的表面有大量Pt NPs和球形顆粒填充于fl-TiO2的花狀結構中，結合RuSi NPs的SEM圖（圖2F）可知，這些球形顆粒為RuSi NPs，顆粒大小均勻，直徑約為70 nm，初步證明fl-Ti O2/Pt NPs/RuSi NPs已成功制備。

圖2 宏觀fl-Ti O2（A），微觀fl-TiO2（B），fl-TiO2/Pt NPs（C），Pt NPs（D），fl-Ti O2/Pt NPs/RuSi NPs（E）及RuSi NPs（F）的SEM圖Fig．2 SEM images of macroscopic fl-TiO2（A），microscopic fl-TiO2（B），fl-TiO2/Pt NPs（C），Pt NPs（D），fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs（E）and RuSi NPs（F）

圖3A展示了RuSi NPs的紫外－可見吸收光譜（曲線a）和熒光光譜（曲線b），可明顯觀察到RuSi NPs在300 nm和450 nm處分別出現(xiàn)了Ru（bpy）32+的特征吸收峰，其最大熒光發(fā)射波長為610 nm，與文獻報道基本一致［23］，說明成功制備了RuSi NPs。fl-TiO2的XRD圖譜（圖3B）在2θ為69．9°和36．3°出現(xiàn)的衍射峰分別對應銳鈦礦二氧化鈦（JCPDS NO．21－1272）的（220）和（103）晶面，在27．6°、39．4°、41．5°、44．2°、54．5°、56．8°、62．9°、64．3°和69．2°出現(xiàn)的衍射峰分別對應金紅石相二氧化鈦（JCPDS NO．21－1276）的（110）、（200）、（111）、（210）、（211）、（220）、（002）、（310）和（301）晶面，表明fl-TiO2是由銳鈦礦相和金紅石相組成的混合晶型。fl-Ti O2/Pt NPs/RuSi NPs的EDS圖譜（圖3C）則表明該材料含有Ti、O、Pt、Ru和Si元素。

圖3 RuSi NPs的紫外－可見吸收光譜及熒光光譜（A），fl-TiO2的XRD圖譜（B）及fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的EDS圖譜（C）Fig．3 UV－Vis absorption spectrum and fluorescence spectrum of RuSi NPs（A），XRD pattern of fl-TiO2（B），and EDS pattern of fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs（C）

2.2 傳感器的電化學行為

采用示差脈沖伏安法（DPV）考察了5．0×10－3mol/L［Fe（CN）6］3－在不同修飾電極上的電化學行為。如圖4A所示，裸GCE產(chǎn)生了一個比較強的電流信號（曲線a），這是［Fe（CN）6］3－在電極表面還原為［Fe（CN）6］4－而產(chǎn)生的還原峰電流；當GCE的表面修飾RuSi NPs后產(chǎn)生的電流信號明顯減小（曲線b），這是由于導電性較差的SiO2阻礙了GCE表面的電子向擴散層中的［Fe（CN）6］3－發(fā)生轉(zhuǎn)移，導致［Fe（CN）6］3－的還原過程受阻；當GCE表面修飾fl-TiO2/RuSi NPs時，響應信號進一步減?。ㄇ€c），這是由RuSi NPs和fl-TiO2對電子傳遞的阻礙作用所致；fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE的電流信號（曲線d）相對于fl-TiO2/RuSi NPs/GCE有所增大，這是因為具有良好導電性和電催化活性的Pt NPs提高了電子在GCE表面的傳遞效率，從而顯著提高了GCE的催化活性。

采用交流阻抗分析（EIS）研究了［Fe（CN）6］3－/4－在不同修飾電極上的電化學行為。如圖4B所示，裸GCE的阻抗值較?。≧et=103Ω，曲線a），表明［Fe（CN）6］3－/4－探針在裸GCE表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移時受到的阻力較??；RuSi NPs/GCE的阻抗（Ret=815Ω，曲線b）相對于裸GCE明顯增大，說明RuSi NPs的導電性較差，對電子的傳遞有阻礙作用；fl-TiO2/RuSi NPs/GCE的阻抗值（Ret=1 261Ω，曲線c）較RuSi NPs/GCE有所增大，說明fl-TiO2的導電性較差，并降低了電子的轉(zhuǎn)移速率；fl-Ti O2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE的阻抗值（Ret=1 125Ω，曲線d）相對于fl-TiO2/RuSi NPs/GCE有所減小，這是因為加入具有良好導電性的Pt NPs改善了RuS NPs/fl-Ti O2的導電性，并加快了［Fe（CN）6］3－/4－在GCE表面的電子轉(zhuǎn)移速率。實驗結果與DPV法一致。

圖4 不同修飾電極的DPV響應（A）及EIS圖譜（B）Fig．4 DPV curves（A）and the corresponding EIS responses（B）of different electrodes a：bare GCE，b：RuSi NPs/GCE，c：fl-Ti O2/RuSi NPs/GCE，d：fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE

2.3 傳感器的ECL行為及檢測機理

在含有2．0×10－3mol/L TPrA的PBS溶液（0．1 mol/L，pH 8．0）中，考察了5種不同電極的ECL圖譜（見圖5）。結果顯示，裸GCE（曲線a，ECL≈2．0 a．u．）幾乎不產(chǎn)生ECL信號，而RuSi NPs/GCE（曲線b，ECL≈9 255 a．u．）、fl-TiO2/RuSi NPs/GCE（曲線c，ECL≈11 510 a．u．）和fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE（曲線d，ECL≈16 320 a．u．）電極則隨著修飾不同材料后，其ECL響應信號逐漸增大。這是因為具有優(yōu)異電催化活性的Pt NPs加快了Ru（bpy）－TPrA體系的ECL反應速率（式1～4），而fl-TiO2的豐富分級微/納米結構則為RuSi NPs和Pt NPs提供了大量的結合位點，并有效縮短了電子在兩者之間傳遞的距離，因此fl-TiO2/Pt NPs復合物可作為RuSi NPs－TPrA體系的ECL信號放大器，三者的結合成功實現(xiàn)了傳感器ECL信號的雙重放大。當ECL反應體系中含有1．0×10－6mol/L PHE時，fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE的ECL響應信號急劇減小（曲線e，ECL≈13 180 a．u．），表明PHE對該傳感器的ECL響應信號有顯著抑制作用，這可能是因為PHE具有兒茶酚胺結構，容易在陽極被氧化為PHE的氧化物，然后進一步和TPrA?反應，導致TPrA?的數(shù)量減少并抑制了RuSi NPs的ECL發(fā)射行為。

圖5 加入1．0×10－6 mol/L PHE前（a～d）后（e），不同電極在2．0×10－3 mol/L TPrA溶液中的ECL圖譜Fig．5 ECL curves of different electrodes in 2．0×10－3 mol/L TPrA solution before（a－d）and after（e）adding 1．0×10－6 mol/L PHEa：bare GCE，b：RuSi NPs/GCE，c：fl-TiO2/RuSi NPs/GCE，d：fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE，e：fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs/GCE；0．1 mol/L PBS（pH 8．0）

2.4 實驗條件的優(yōu)化

考察了fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs混合物中fl-TiO2/Pt NPs用量對傳感器的影響，如圖6A所示，在fl-TiO2/Pt NPs的用量為2～6 mL范圍內(nèi)，傳感器的ECL響應信號隨著fl-TiO2/Pt NPs用量的增加而增強，當fl-TiO2/Pt NPs的用量繼續(xù)增加至10 mL時，ECL響應信號則逐漸減小，因此選取6 mL作為fl-TiO2/Pt NPs的最佳用量。fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的修飾量對傳感器的影響如圖6B所示，隨著fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的修飾量由2μL逐漸增加至4μL時，產(chǎn)生的ECL響應信號逐漸增至最大值，當修飾量繼續(xù)增大至6μL時，ECL信號則逐漸減弱，這是因為大量的fl-TiO2和RuSi NPs堆積于GCE表面時，易造成電子在電極表面的運動受阻，從而抑制了ECL信號的產(chǎn)生，因此選擇fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs的最佳修飾量為4μL。ECL反應體系pH值對傳感器的影響如圖6C所示，pH值在6．0～10．0范圍內(nèi)對傳感器響應的ECL信號產(chǎn)生顯著影響，且當pH 8．0時，傳感器的ECL信號最強，因此選取pH 8．0作為ECL反應體系的最佳pH條件。

圖6 fl-TiO2/Pt NPs用量（A）、fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs修飾量（B）及pH值（C）對ECL反應體系的影響Fig．6 Effects of fl-TiO2/Pt NPs amount（A），fl-TiO2/Pt NPs/RuSi NPs modification amount（B）and pH value（C）on ECL reaction system

2.5 工作曲線與檢出限

在最佳實驗條件下，將傳感器用于檢測不同濃度的PHE，如圖7所示，隨著PHE的濃度由0 mol/L逐漸增至8．0×10－5mol/L，傳感器的ECL響應信號逐漸減小。在1．0×10－7～8．0×10－5mol/L濃度范圍內(nèi)，ECL響應信號的變化值ΔI（ΔI=I0－IPHE）與PHE濃度的對數(shù)（lgCPHE）呈良好的線性關系，線性方程為ΔI（a．u．）=2 652．12lgCPHE（mol/L）+19 008．06，相關系數(shù)（r2）為0．998 4，檢出限（S/N=3）為2．5×10－8mol/L。與部分文獻（表1）報道的PHE檢測方法相比，本文所制備的傳感器表現(xiàn)出更寬的檢測范圍和更低的檢出限。

圖7 傳感器對不同濃度PHE的ECL響應Fig．7 ECL curves of the proposed sensor at different concentrations of PHE concentration of PHE（1－8）：0，1．0，5．0，10，50，100，500，800（×10－7 mol/L）

表1 與其他PHE檢測方法的對比Table 1 Comparisons of the linear range and detection limit of this work with the other PHE detection methods

2.6 傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與選擇性

考察了單根修飾電極在7天內(nèi)對1．0×10－6mol/L PHE的檢測效果，測得第7天響應的ECL信號仍保持為初始值的96．6%，相對標準偏差（RSD）為1．3%；在相同實驗條件下，將平行制備的5根修飾電極用于檢測1．0×10－6mol/L PHE，響應信號的RSD為1．0%，表明傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。選用幾種常見離子、輔料以及具有相似結構的物質(zhì)作為干擾物，與傳感器對1．0×10－6mol/L PHE的檢測結果進行對比。結果表明，100倍的Na+、Ca2+、K+、Mg2+、CO2-3、檸檬酸（CA）和葡萄糖（GLU），80倍的對乙酰氨基酚（APAP），45倍的OH－和抗壞血酸（AA），40倍的多巴胺（DA）對PHE的檢測結果影響較?。ㄕ`差在±5%以內(nèi)），表明傳感器具有良好的選擇性。

2.7 實際樣品的檢測

在優(yōu)化條件下，對PHE注射液中的PHE濃度進行測定，測得其濃度為3．3×10－7mol/L。采用標準加入法對注射液分別進行3個不同濃度水平的加標，測得回收率為99．2%～108%，且RSD均低于5%（見表2）。說明該傳感器在實際樣品的檢測中具有良好的可行性。

表2 鹽酸去氧腎上腺素注射液中PHE含量的測定及回收率結果Table 2 Determination of PHE in phenylephrine hydrochloride injection and its recoveried results

3 結 論

本文成功構建了基于fl-Ti O2/Pt NPs/RuSi NPs的新型固態(tài)ECL傳感器，并用于藥物中PHE的檢測。fl-TiO2/Pt NPs顯著提高了RuSi NPs的ECL發(fā)射效率，實驗結果表明該傳感器具有較寬的檢測范圍和較低的檢出限，并表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。本研究為ECL傳感平臺的構建提供了一種新的ECL信號放大策略，并拓寬了ECL傳感器在藥物分析中的應用。