微小RNA-140對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷及凋亡的影響*

秦丹丹， 李 強(qiáng)， 劉 璟

湖北省荊門市第二人民醫(yī)院綜合病房，荊門 448000

近年來(lái)，我國(guó)糖尿病發(fā)病率不斷增加，目前患病人數(shù)已經(jīng)超過(guò)1億人，已成為公共健康問(wèn)題，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。高血糖是糖尿病的重要臨床表現(xiàn)，長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致血管病變、神經(jīng)病變等一系列慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。其中，高血糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷是導(dǎo)致糖尿病患者預(yù)后不良及并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機(jī)制[2-3]。因此，進(jìn)一步深入研究高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷及凋亡機(jī)制對(duì)防治糖尿病并發(fā)癥具有重要的臨床意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在且進(jìn)化高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等多種復(fù)雜的生命調(diào)控過(guò)程[4]。miR-140為miRNAs家族的重要成員，在多種腫瘤中低表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲的作用[5-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-140可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)在骨關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中起作用[7-8]。但miR-140對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷及凋亡的影響尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究將通過(guò)探討miR-140對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)炎性損傷及凋亡的影響，以期為防治糖尿病并發(fā)癥提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)、DMEM培養(yǎng)液、化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)：R-HIAS-649、ZY-P0032、ZY-11256)購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號(hào)：11668019、BC3640、PT0001、K000323P、K001435M、M1000110、SR134)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；CCK-8試劑、Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin1β，IL-1β)抗體(貨號(hào)：QN1293-OIR、WE0325-THR、K18201-UTG)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；negative control-miR-140、miR-140 mimics均由廣州市銳博生物科技有限公司合成；熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：DEM202-50 T)購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(貨號(hào)：ATA38860)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；人IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號(hào)：SEKMY-0002-96 Time、SEKRT-0402-96 Time)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購(gòu)自日本松下公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：ABI 7500)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：MODEL550)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：BD FACSCantoⅡ)購(gòu)自美國(guó)BD公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiDocXRS)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)期HUVECs以1×105個(gè)/mL、100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組(5 mmol/L D-葡萄糖)；高糖組(30 mmol/L D-葡萄糖)；陰性對(duì)照組(30 mmol/L D-葡萄糖+轉(zhuǎn)染negative control-miR-140)；miR-140過(guò)表達(dá)組(30 mmol/L D-葡萄糖+轉(zhuǎn)染miR-140 mimics)。陰性對(duì)照組、miR-140過(guò)表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組HUVECs中miR-140表達(dá)情況 將1.2.1中4組HUVECs培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)miR-140表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)閁6。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 25 s，72℃ 30 s，共循環(huán)45次；72℃ 10 min。miR-140上游引物：5′-GCCGCAGTGGTTTTACCCT-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到臨界閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，miR-140相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)各組HUVECs增殖情況 將1.2.1中4組HUVECs培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HUVECs凋亡情況將1.2.1中4組HUVECs培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，胰蛋白酶消化，PBS洗滌，使用400 μL 1×結(jié)合緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書步驟，分別加入Annexin Ⅴ-FITC、PI各5 μL，避光孵育1 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)各組HUVECs中PCNA、Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)情況 將1.2.1中4組HUVECs培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PDVF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入PCNA抗體、Bax抗體、IL-1β抗體、TNF-α抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白的相對(duì)含量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)各組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌情況 將1.2.1中4組HUVECs培養(yǎng)48 h，收集上清液。ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-α分泌情況，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定A值，計(jì)算IL-1β、TNF-α分泌含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組HUVECs中miR-140表達(dá)情況

與空白對(duì)照組相比，高糖組、陰性對(duì)照組miR-140表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)；與高糖組相比，陰性對(duì)照組HUVECs中miR-140表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs中miR-140表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與陰性對(duì)照組相比，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs中miR-140表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組HUVECs中miR-140表達(dá)情況Table 1 Expression of miR-140 in HUVECs of each group

2.2 各組HUVECs增殖、凋亡情況

與空白對(duì)照組相比，高糖組、陰性對(duì)照組HUVECs增殖水平均顯著降低，凋亡率顯著升高(均P<0.05)；與高糖組相比，陰性對(duì)照組HUVECs增殖水平，凋亡率均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，與高糖組陰性對(duì)照組相比，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs增殖水平顯著升高，凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組HUVECs增殖、凋亡情況Table 2 Proliferation and apoptosis of

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HUVECs凋亡情況Fig.1 Apoptosis of HUVECs in each group was detected by flow cytometry

2.3 各組HUVECs中PCNA、Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)情況

與空白對(duì)照組相比，高糖組、陰性對(duì)照組HUVECs中PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；與高糖組相比，陰性對(duì)照組HUVECs中PCNA、Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs中PCNA蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)；與陰性對(duì)照組相比，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs中PCNA蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組HUVECs中PCNA、Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of PCNA，Bax，IL-1β and TNF-α protein in HUVECs in each group detected by Western blotting

表3 各組HUVECs中PCNA、Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)情況Table 3 PCNA，Bax，IL-1β，and TNF-α protein expression in HUVECs in each

2.4 各組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌情況

與空白對(duì)照組相比，高糖組、陰性對(duì)照組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌水平顯著升高(均P<0.05)；與高糖組相比，陰性對(duì)照組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌水平無(wú)顯著差異(均P>0.05)，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌水平顯著降低(均P<0.05)；與陰性對(duì)照組相比，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌水平顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌情況Table 4 The secretion of IL-1β and TNF-α of

3 討論

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，其在中國(guó)成人中發(fā)病率已達(dá)11.6%[9]。糖尿病心血管病變、視網(wǎng)膜病變等多種并發(fā)癥均始于內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，以內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速、內(nèi)皮細(xì)胞因子分泌失衡為主要表現(xiàn)[10-11]。內(nèi)皮細(xì)胞是重要的自分泌和旁分泌組織，作為血管的機(jī)械屏障，通過(guò)調(diào)節(jié)血管張力、血流速度及氧化應(yīng)激、抑制血管炎癥等，在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，高糖組HUVECs的miR-140表達(dá)水平、細(xì)胞增殖水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示高糖會(huì)導(dǎo)致HUVECs中miR-140表達(dá)下調(diào)，加重炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞增殖同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，進(jìn)一步研究高糖狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制，對(duì)探尋糖尿病并發(fā)癥防治的新靶點(diǎn)具有重要意義。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，生物體內(nèi)存在的許多miRNA分子，通過(guò)對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄后抑制的調(diào)控方式，參與生物多種生命過(guò)程。目前，miRNA的研究主要集中在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，miR-140作為miRNA分子，在大多數(shù)腫瘤組織及細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用，是腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。陳翔等[12]研究表明，miR-140在骨肉瘤中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-140后可抑制骨肉瘤U2細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)其凋亡。梁帥等[13]研究表明，miR-140可靶向高遷移率蛋白B1抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，與高糖組、陰性對(duì)照組相比，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs中miR-140表達(dá)水平、細(xì)胞增殖水平顯著升高，HUVECs凋亡率顯著降低，提示過(guò)表達(dá)miR-140可促進(jìn)HUVECs增殖并抑制其凋亡。

除調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展外，有文獻(xiàn)證實(shí)miR-140還可調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)并抑制組織損傷。賈良良等[14]研究表明，補(bǔ)腎壯筋湯通過(guò)調(diào)節(jié)miR-140表達(dá)抑制脂多糖介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)，從而抑制脂多糖介導(dǎo)軟骨細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)紊亂，保護(hù)軟骨細(xì)胞功能。王娓娓等[15]研究表明，燈盞花素可能是通過(guò)上調(diào)miR-140表達(dá)，抑制缺血-再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與高糖組、陰性對(duì)照組相比，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs中PCNA蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示過(guò)表達(dá)miR-140可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)因子PCNA表達(dá)，抑制促細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax及促炎因子IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)，促進(jìn)HUVECs增殖、抑制其凋亡并降低炎癥反應(yīng)損傷[16-17]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與高糖組、陰性對(duì)照組相比，miR-140過(guò)表達(dá)組HUVECs的IL-1β、TNF-α分泌水平顯著降低，提示過(guò)表達(dá)miR-140不僅抑制HUVECs中IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制IL-1β、TNF-α分泌過(guò)程。

綜上所述，miR-140可能通過(guò)降低炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)與分泌，下調(diào)促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)因子PCNA蛋白表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷及凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，但miR-140在其他血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究與完善。