大孔樹脂純化襄荷黃酮提取物及其對小鼠運動性疲勞的影響

李 奕

（中國戲曲學院體育部，北京 100073）

襄荷（Zingiber mioga（Thunb.）Rosc）為姜科屬多年生草本植物，具有活血調經、消腫解毒的功效，是保健食品的主要成分[1-2]，富含多糖、黃酮、氨基酸、維生素等化學物質[3-4]。目前國內外對于襄荷的研究多集中于栽培繁殖、提取分離等方面，其中許遠和張思頡等[5-6]曾利用乙醇超聲提取襄荷總黃酮，并發(fā)現其在體外對多數活性氧自由基具有較好的清除作用，但未深入探究其體內活性。“運動性疲勞”主要源于劇烈運動時體內生成的大量活性氧或自由基導致肌肉組織的損傷和收縮能力的下降，進而影響身體的持續(xù)運動[7-8]。目前某些天然化合物已被發(fā)現其體、內外抗氧化活性高度相關[9]，本研究利用大孔樹脂具有機械篩分與吸附分離雜質的特性[10-11]，采用其純化襄荷黃酮提取物，并考察純化產物對小鼠運動性疲勞的影響，從而為有關襄荷運動食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

新鮮襄荷采自湖北恩施市；西洋參：昆明邦宇制藥有限公司生產；蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定研究院；乳酸（LA）、尿素氮（BUN）和乳酸脫氫酶（LDH）活力檢測試劑盒：泉州九邦生物科技有限公司；試驗用水為去離子水；其余試劑均為分析純；試驗動物：雄性小鼠100只，體重18～25 g，喂養(yǎng)環(huán)境溫度：20～25℃、相對濕度：50%～70%，由北京實驗動物中心提供。

1.1.2 儀器與設備

UV-8000型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；DT-J300型制樣粉碎機：湖南頂特科技有限公司；BSA124S型電子天平：賽多利斯公司；TL-ST250型超聲波細胞粉碎機、FD-1A-50型冷凍干燥箱：江蘇天翎儀器有限公司；RE-201D型旋轉蒸發(fā)儀：上海岐耀儀器設備有限公司；KH20R-II型高速離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；THD-200型恒溫振蕩器：北京亞泰科隆儀器有限公司；AB-8、H-103、D-101型大孔樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；HPD 400、NKA-9型大孔樹脂：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酮提取液的制備

依照文獻[5]的方法制備襄荷黃酮提取液，最小提取量的具體操作如下：將襄荷根、葉、花苞洗凈后烘干、粉碎，取10.0 g過80目篩后樣品，加入至200 mL 80%乙醇溶液超聲提?。囟?0℃，功率100 W）。濾渣經3次重復提取后，合并濾液，蒸發(fā)濃縮移至100mL容量瓶內，加入60%乙醇溶液定容、搖勻，即得黃酮提取液。

1.2.2 黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，平行6次測定不同濃度標準品溶液中總黃酮含量[12]，繪制標準曲線方程：y=1.043x+0.011 7（r=0.993 6），其中橫坐標為質量濃度，縱坐標為吸光度值。隨后，不同洗脫液樣品通過標準曲線方程確定總黃酮含量，減壓蒸發(fā)，濃縮干燥后稱重，進而得到產物的黃酮純度。

1.2.3 樹脂型號選擇

分別稱取5.0g預處理后的H-103、D-101、AB-8、HPD-400、NKA-9樹脂[13]，放入裝有6 mg/mL 60 mL黃酮提取液的錐形瓶內，在室溫下靜態(tài)吸附12 h后過濾。飽和吸附后的樹脂經一定量水洗至無提取液殘留后，置于錐形瓶內，加入60%乙醇100 mL，室溫靜置12 h后過濾，按照下列公式計算不同類型樹脂的飽和吸附量、飽和吸附率、洗脫率及回收率[14]。

式中：me為吸附平衡后總黃酮質量，mg；m0為樣液初始總黃酮質量，mg；m為樹脂干重，g；md為洗脫液中總黃酮質量，mg；τe為飽和吸附量，mg/g；Qe為飽和吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R為回收率，%。

1.2.4 等溫吸附試驗

向裝有5.0 g AB-8大孔樹脂的錐形瓶內分別加入濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的黃酮提取液60 mL，于25、35、45℃振蕩吸附，測得樹脂的飽和吸附量，繪制等溫吸附線，并利用Langmuir與Freundlich模型擬合[15]。

式中：Qm為黃酮飽和吸附量，mg/g；Qe為黃酮吸附量，mg/g；Kb為Langmuir方程常數；Ce為濾液黃酮濃度，mg/mL；Kf為Freundlich方程常數。

1.2.5 靜態(tài)吸附動力學曲線

向裝有6 mg/mL襄荷黃酮提取液60 mL的錐形瓶內加入5.0 g AB-8大孔樹脂，于25℃振蕩吸附，在不同時間取樣檢測上清液中黃酮含量，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線[16]。

1.2.6 動態(tài)吸附與洗脫條件考察

固定上樣濃度6 mg/mL、上樣液pH為6、上樣流速3 mL/min和上樣液體積60 mL，考察不同上樣濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）、不同上樣液pH（3、4、5、6、7）對樹脂的吸附率影響，繪制不同上樣流速（1、3、5 mL/min）時樹脂泄漏曲線；固定洗脫液乙醇濃度60%、洗脫液體積150 mL、洗脫流速2 mL/min，考察不同洗脫液濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對黃酮化合物洗脫率的影響及1、2、3 mL/min洗脫流速下的洗脫曲線。

1.2.7 抗運動性疲勞實驗

1.2.7.1 試驗設計

所有小鼠經適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機平均分為空白對照組、陽性對照組和低、中、高劑量組，根據《保健食品功能評價》要求，低、中、高劑量組分別灌胃純化后的黃酮化合物0.10、0.20、0.30 mg/（g·d），陽性對照組給予西洋參灌胃0.10 mg/（g·d），空白對照組則采用生理鹽水灌胃，全部動物每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[17-18]。

1.2.7.2 負重游泳試驗

最后一次灌胃結束后，各組隨機抽取10只小鼠，并在鼠尾綁定5%體重重物，放入泳池游泳，記錄其入水到沉入水底超過10 s的時間[19]。

1.2.7.3 體內生化指標檢測

剩余小鼠游泳運動60 min后，放入鼠籠休息10 min，處死采取血清，按照相關試劑盒使用說明，檢測各組小鼠運動后體內LA、BUN濃度和LDH活力[20]。

1.2.8 數據處理

相關試驗數據通過SPSS19.0軟件進行方差分析，比較組間差異，當P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同類型樹脂吸附與解吸性能比較

表1為不同型號樹脂對襄荷黃酮的吸附與解吸性能，從表1可見，各類樹脂對襄荷黃酮的吸附率與洗脫率差異明顯，究其原因在于各類樹脂的比表面積與極性不同。AB-8大孔樹脂對襄荷黃酮的吸附率最高，達到89.2%，且回收率超過80%，其他樹脂對其回收率從高到底依次為：HPD-400＞H-103＞D-101＞NKA-9，這可能源于黃酮化合物的結構中存在較多羥基衍生物，具有一定極性，因此與弱極性樹脂的相互作用較好[21]，因而確定采用AB-8樹脂進行后續(xù)試驗。

表1 不同樹脂的吸附率、洗脫率及回收率比較Table 1 Comparison of adsorption rate,elution rate and recovery rate of different resins(n=6)

2.2 等溫吸附試驗

圖1為AB-8大孔樹脂于不同溫度對襄荷黃酮的等溫吸附曲線，隨著提取液濃度的增大，樹脂的飽和吸附量逐漸增大，然而隨著溫度升高，其飽和吸附量卻不斷減小，分別利用Langmuir和Freundlich吸附模型對其等溫吸附線擬合，見表2。從表2可知，在不同溫度下，AB-8大孔樹脂的吸附曲線符合Langmuir模型特征，各方程的相關系數均大于0.95。

表2 等溫吸附線擬合方程Table 2 The fitting equations of adsorption isotherms

圖1 等溫吸附曲線Fig.1 Adsorption isothermsin different temperatures

2.3 靜態(tài)吸附動力學曲線

從圖2可知，在0～3 h內，樹脂對黃酮的吸附率迅速升高，隨后緩慢于6 h達到平衡，表明AB-8大孔樹脂對襄荷黃酮的吸附速率較快，具有實際應用前景。

圖2 AB-8大孔樹脂對襄荷黃酮的靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.2 The static adsorption kinetics curve of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavonoid by AB-8 macroporousresin

2.4 吸附條件選擇

2.4.1 上樣濃度對吸附率的影響

圖3為不同上樣濃度對AB-8樹脂吸附襄荷黃酮的影響，當上樣濃度為6 mg/mL時，吸附率達到最高為87.8%，上樣濃度過高時，黃酮溶解度下降，容易導致樹脂的堵塞或泄露，同時競爭吸附的雜質也越來越多，致使黃酮吸附率進一步降低，因此襄荷黃酮最適宜上樣濃度為6 mg/mL。

圖3 上樣濃度對吸附率的影響Fig.3 Effect of sampleconcentration on the adsorption rate

2.4.2 上樣液pH對吸附率的影響

圖4為不同上樣液pH對AB-8樹脂吸附襄荷黃酮的影響，從圖4可見，吸附率隨pH的升高出現先增大后減小的趨勢。當pH為6時，吸附率達到最高，為88.4%，這可能源于黃酮化合物的化學結構含有1-氧原子，存在未共用電子對，表現出堿性，因而在強酸下易形成“徉鹽”，不利于樹脂的吸附，這與黃酮純化相關研究結果一致[22-23]，因此考慮最適宜上樣液pH為6。

圖4 上樣液pH對吸附率的影響Fig.4 Effect of sample pH on the adsorption rate

2.4.3 不同上樣流速下樹脂泄漏曲線

圖5為不同上樣流速下樹脂的泄露曲線，從圖中可知，隨著上樣液體積的增加，泄露液中黃酮化合物的濃度逐漸增大至完全等于上樣液初始濃度，這歸因于若上樣液體積過多且流速過快時，黃酮化合物不能與樹脂充分接觸發(fā)生吸附作用，且樹脂易于過載。通常認為泄漏液中黃酮濃度約為10%上樣濃度時，樹脂開始泄漏，考慮實際吸附效率，選擇最適宜上樣流速為3 mL/min，上樣液體積60 mL。

圖5 不同上樣流速下樹脂的泄漏曲線Fig.5 The leakagecurve of resin at different loading flow rates

2.5 洗脫條件選擇

2.5.1 洗脫液濃度對洗脫率的影響

圖6為不同濃度洗脫液對樹脂洗脫率的影響，當洗脫液乙醇濃度超過60%時，樹脂的洗脫率開始逐漸降低，這是由于洗脫液濃度越大，其極性愈低，易于洗脫黃酮，但濃度過高時，其與黃酮化合物的極性差異明顯，洗脫難度變大，因此洗脫液乙醇的最適宜濃度為60%。

圖6 洗脫液濃度對洗脫率的影響Fig.6 Effect of eluent concentration on theelution rate

2.5.2 不同洗脫流速的解吸曲線

若洗脫流速過快，洗脫劑與樹脂內吸附的黃酮作用力變弱，為此考察不同洗脫流速下的解吸曲線，結果見圖7。隨著洗脫流速增大，完全洗脫吸附在樹脂內的襄荷黃酮所消耗的洗脫劑用量越來越多，當以2 mL/min流速洗脫吸附樹脂時，洗脫曲線單一、對稱、尖銳且無明顯拖尾，因此選擇最宜洗脫流速為2 mL/min，洗脫液體積150 mL。

圖7 三種洗脫流速下的解吸曲線Fig.7 Thedesorption curveat three eluent flow rate

2.6 驗證性試驗

綜上所述，確定大孔樹脂純化襄荷黃酮提取物的最佳純化工藝為：60 mL上樣濃度為6 mg/mL襄荷黃酮（pH 6.0），上樣流速3 mL/min，洗脫流速為2 mL/min，洗脫液乙醇濃度60%，洗脫液體積為150 mL，飽和吸附率與洗脫率分別達到87.5%和90.3%，產物的總黃酮純度由11.25%±0.46%提高至47.52%±1.37%，約為4.2倍，表明通過AB-8大孔樹脂純化后，襄荷黃酮提取物中的蛋白、色素等雜質被有效去除，因此該樹脂適于襄荷黃酮提取物的純化。

2.7 抗運動性疲勞實驗結果

2.7.1 襄荷黃酮對小鼠負重游泳時間的影響

負重游泳時間可真實反映動物的運動耐力。從表3可知，在設定的劑量范圍內，隨著純化產物劑量的增大，動物負重游泳時間呈現出一定的劑量依賴性。與空白對照組相比，中、高劑量組動物的負重時間均有延長，具有極顯著性差異（P＜0.01），表明中、高劑量的襄荷黃酮有助于提高機體的運動耐力，延長運動時間，而低劑量組雖有延長，但差異不顯著，這可能與劑量選擇或小鼠的個體差異有關，但陽性對照組小鼠的游泳時間較高劑量組延長1.79 min，差異具有極顯著性（P＜0.01）。

表3 襄荷黃酮對小鼠負重游泳時間的影響Table 3 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavonesonexhaustive swimming time of mice

2.7.2 襄荷黃酮對乳酸相關指標的影響

機體過度運動，易造成細胞缺氧，使得部分血糖轉化成乳酸，從而影響肌肉張力，而乳酸脫氫酶有利于催化乳酸脫氫，加快其代謝排出[24]。運動后不同組別小鼠體內的乳酸濃度與乳酸脫氫酶活力結果見表4。從表4可知，與空白對照組相較，襄荷黃酮低、中、高劑量組小鼠的體內乳酸濃度均明顯偏低，且乳酸脫氫酶活力均有一定幅度的增強，表明襄荷黃酮有助于改善運動后小鼠體內的乳酸與乳酸脫氫酶水平，高劑量小鼠的乳酸濃度較陽性對照組高1.08 mmol/L，乳酸脫氫酶活力較陽性對照組低413 U/L，具有極顯著差異（P＜0.01）。

表4 襄荷黃酮對小鼠BLA濃度和LDH活力的影響Table 4 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavoneson BLA concentration and LDH activity in mice

2.7.3 襄荷黃酮對尿素氮濃度的影響

機體劇烈運動，導致血糖供應不足，容易造成體內蛋白質或氨基酸的分解利用，致使代謝產物尿素氮濃度增大[25]。表5為運動后不同組別動物體內尿素氮濃度，從表5可知，空白對照組的尿素氮濃度與低劑量組相較無顯著性差異，而中、高劑量組小鼠的尿素氮濃度均明顯低于空白對照組，表明機體在劇烈運動時，中、高劑量的襄荷黃酮有利于減少體內蛋白質分解，高劑量組與陽性對照組均與空白對照組有極顯著差異（P＜0.01）。

表5 襄荷黃酮對小鼠BUN濃度的影響Table5 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavoneson BUN concentration in mice

3 結論

本研究探討了大孔樹脂純化襄荷黃酮的最佳工藝條件，并分析純化產物對小鼠運動性疲勞的影響。通過單因素試驗得到最佳純化工藝條件為：60 mL上樣濃度為6 mg/mL襄荷黃酮（pH 6.0），上樣流速3 mL/min，洗脫流速為2 mL/min，洗脫液乙醇濃度60%，洗脫液體積為150 mL，產物的總黃酮純度由11.25%提高至47.52%，約為4.2倍。從動物實驗結果可知，襄荷黃酮可明顯延長小鼠的負重游泳時間，增強乳酸脫氫酶的活性，降低了機體的尿素氮含量，從而減小運動過程中乳酸的生成及蛋白質或氨基酸的分解，因此該研究可為襄荷黃酮的抗疲勞功能性食品的開發(fā)提供參考，有利于促進該資源的開發(fā)利用。