玉米籽粒缺陷突變基因dek54的精細(xì)定位及候選基因分析

周 練 劉朝顯 陳秋欄 王文琴 姚 順 趙子堃 朱思穎 洪祥德 熊雨涵 蔡一林

玉米籽粒缺陷突變基因的精細(xì)定位及候選基因分析

周 練 劉朝顯 陳秋欄 王文琴 姚 順 趙子堃 朱思穎 洪祥德 熊雨涵 蔡一林*

西南大學(xué)玉米研究所 / 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 / 南方山地作物逆境生物學(xué)國家級(jí)培育基地, 重慶 400715

玉米籽粒與產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān), 控制籽粒發(fā)育基因的功能研究對(duì)解析籽粒發(fā)育分子機(jī)制, 提高玉米產(chǎn)量, 改善籽粒營養(yǎng)品質(zhì)提供重要依據(jù)。利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)處理B73花粉, 篩選到一個(gè)玉米籽粒缺陷突變體()。表現(xiàn)出成熟籽粒變小、皺縮、顏色發(fā)白等特征; 遺傳分析表明是一個(gè)單基因控制的隱性突變體。石蠟切片顯示淀粉胚乳細(xì)胞形狀不規(guī)則且排列致密, 掃描電鏡觀察成熟籽粒胚乳中心區(qū)域發(fā)現(xiàn)淀粉粒周圍蛋白體比野生型少且排列疏松。成熟籽粒的總蛋白、醇溶蛋白、各氨基酸組分和全氮含量相比野生型都顯著降低。利用F2分離群體中的1566個(gè)單株, 把定位在7號(hào)染色體標(biāo)記SSR6和SSR7之間, 物理位置約為290 kb。該區(qū)間有3個(gè)基因, 基因測序發(fā)現(xiàn)基因第2個(gè)外顯子上第351個(gè)堿基由G突變?yōu)锳, 從而導(dǎo)致蛋白翻譯的提前終止。該基因在玉米籽粒中特異性表達(dá), 且在12 DAP (days after pollination)籽粒中表達(dá)量最高。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行靶向突變確定候選基因?qū)е略撏蛔儽硇汀＞幋a一個(gè)與ZmNRT1.5 (nitrate transporter)具有較高同源性的MFS (major facilitator superfamily)家族蛋白并定位在玉米原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)膜。該研究為揭示在玉米籽粒發(fā)育的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

玉米;; 籽粒發(fā)育; 精細(xì)定位

玉米(L.)作為一年生禾本科植物, 是我國重要的糧食作物。玉米生產(chǎn)對(duì)保障我國糧食安全有著重要的戰(zhàn)略意義。隨著世界人口和經(jīng)濟(jì)水平的不斷增長, 對(duì)玉米產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)的要求日益增長。玉米的胚和胚乳作為籽粒的主要組成部分, 來自植物雙受精作用, 與玉米產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān)。玉米籽粒主要是由淀粉、蛋白質(zhì)和油脂組成。其中淀粉和蛋白質(zhì)主要儲(chǔ)存在胚乳中, 油脂主要存在胚中。玉米胚乳由4種不同類型的細(xì)胞組成, 包括淀粉胚乳細(xì)胞、基部胚乳轉(zhuǎn)移層細(xì)胞、糊粉層細(xì)胞和胚包圍層細(xì)胞[1-2]。8~14 DAP胚乳細(xì)胞具有很強(qiáng)的有絲分裂活性, 到20~25 DAP時(shí)有絲分裂細(xì)胞只在包含糊粉層和亞糊粉層的外周細(xì)胞層增殖。淀粉胚乳細(xì)胞在胚乳的中央?yún)^(qū)域, 10 DAP淀粉胚乳細(xì)胞從有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)楹藘?nèi)復(fù)制[1]。淀粉胚乳細(xì)胞儲(chǔ)存籽粒中大部分的淀粉和蛋白質(zhì), 有效地決定籽粒質(zhì)地和營養(yǎng)品質(zhì)。玉米籽粒胚乳的外側(cè)是蛋白體含量較多的透明區(qū)域, 而中心則是由較多淀粉粒和少量蛋白體組成的不透明區(qū)域。淀粉粒和蛋白體之間的比例決定著玉米籽粒的硬度, 也是玉米品質(zhì)的重要影響因素。玉米胚乳蛋白的質(zhì)量也會(huì)影響玉米營養(yǎng)品質(zhì)和病蟲害抗性。胚乳蛋白中醇溶蛋白(zein)的含量占籽粒總蛋白量的70%左右, 但醇溶蛋白中人體必需的賴氨酸含量低, 極大的降低了玉米的營養(yǎng)價(jià)值。因此, 醇溶蛋白和非醇溶蛋白的比例也是決定玉米籽粒品質(zhì)的重要因素之一。

隨著玉米全基因組測序的完成, 玉米籽粒發(fā)育及產(chǎn)量相關(guān)的基因功能研究逐漸成為熱點(diǎn)。玉米具有大量的籽粒突變體, 這些突變體籽粒表型表現(xiàn)異常。根據(jù)遺傳學(xué)分析, 可以分為3種不同的類型, 包括: (1) 單基因隱性突變體:突變體[3-6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]和[12]等,突變體影響籽粒胚和胚乳的發(fā)育, 使籽粒產(chǎn)生嚴(yán)重缺陷。例如突變體產(chǎn)生小粒的胚致死表型,基因編碼一種線粒體核糖體蛋白L9, 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和籽粒發(fā)育[12]。突變體[13]、[14-15]、[16]、[17]、[18]和[19]等,突變體籽粒粉質(zhì)化, 通過改變醇溶蛋白含量從而影響胚乳質(zhì)地和蛋白品質(zhì)。例如突變體基因編碼蛋白影響19-kD和22-kD α-zein以及16-kD γ-zein的合成, 從而引起蛋白體數(shù)量減少和變小, 出現(xiàn)粉質(zhì)胚乳表型[17]。(2) 顯性突變體(Mc)[20]和(De-B30)[21], DeB30突變體籽粒的非醇溶蛋白比正常籽粒增加了約70%。(3) 半顯性突變體[22]和[23],突變體也會(huì)引起胚乳粉質(zhì)化。例如由于單個(gè)氨基酸的突變使得22 kD α-zein的信號(hào)肽不能正常剪切從而導(dǎo)致蛋白體異常[23]。由于玉米基因組大, 且轉(zhuǎn)座子元件較多, 相比水稻等主要糧食作物, 仍有大量籽粒突變基因的功能及分子機(jī)制仍然不清楚。

本研究利用EMS處理玉米自交系B73花粉得到一個(gè)籽粒缺陷突變體(根據(jù)已發(fā)表的突變體順序命名)。本研究觀察了籽粒形態(tài)學(xué)和組織學(xué)結(jié)構(gòu), 分析了籽粒相關(guān)生化成分; 通過與Mo17構(gòu)建的F2分離群體對(duì)進(jìn)行了基因定位, 并通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變確定了候選基因; 分析了基因在不同組織的時(shí)空表達(dá)情況及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)和同源性比對(duì), 明確了Dek54蛋白的細(xì)胞質(zhì)膜定位結(jié)果。該研究解析在玉米籽粒發(fā)育中的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 dek54突變體獲得和分離群體構(gòu)建

2015年春, 于重慶北碚田間種植玉米自交系B73和Mo17, 收集B73花粉進(jìn)行EMS (終濃度0.67 mL L–1)誘變處理; 將誘變處理后的花粉與Mo17植株進(jìn)行雜交。同年下半年, 把獲得的M0代籽粒種植于云南元江, 自交后收獲果穗, 觀察表型, 篩選出了籽粒皺縮突變體。繼續(xù)用為母本與Mo17雜交, 構(gòu)建F2分離群體。提取1566個(gè)植株DNA, 鑒定其基因型, 篩選重組單株, 對(duì)進(jìn)行精細(xì)定位。

1.2 石蠟切片和掃描電鏡觀察

分別取16 DAP果穗上的野生型和未成熟籽粒, 在福爾馬林-乙酸-乙醇固定液(FAA, 50%乙醇, 0.9 mmol L–1冰醋酸, 3.7%甲醛)中4℃固定過夜。將樣品放置在一系列乙醇和二甲苯梯度溶液中脫水, 在石蠟中進(jìn)行包埋。將石蠟樣本切成10 μm的厚度,經(jīng)烤片并脫水后, 用1%番紅和固綠(Amresco)染色。熒光顯微鏡下(Leica, D3000)進(jìn)行觀察。分別取F2果穗上野生型和的成熟籽粒, 經(jīng)臨界干燥、斷面噴金后, 在掃描電鏡下(Hitachi, SU3500)觀察與野生型的籽粒相同部位胚乳形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。

1.3 籽粒蛋白、淀粉、氨基酸和全氮含量測定

分別取F2群體中同一個(gè)果穗上野生型和的成熟籽粒, 用水浸泡5 min, 并去除種皮和胚。將剩余胚乳部分在液氮中研磨成細(xì)粉。將真空抽干粉末各稱取50 mg兩份, 加入1 mL石油醚, 置于37℃搖床1 h; 去除石油醚, 加入硼酸鈉蛋白提取液和巰基乙醇, 37℃搖床過夜。分別提取每個(gè)樣品的總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白, 并進(jìn)行蛋白含量測定[17]?？偟矸酆康臏y量按照總淀粉測定試劑盒(Megazyme, K-TSTA-100A)使用說明進(jìn)行。將樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)水解, 去除脂質(zhì)、色素等, 使用全自動(dòng)氨基酸分析儀(Hitachi, L-8900)測定氨基酸含量, 每個(gè)樣品3次重復(fù)。將樣品用濃硫酸/雙氧水進(jìn)行消煮, 使用凱氏定氮儀(Alva, KN580)測定全氮含量。

1.4 dek54連鎖標(biāo)記篩選及精細(xì)定位

在F2群體中分別選擇10株野生型和10株突變體, 提取基因組DNA, 并等量混合, 構(gòu)建突變體DNA池(mutant DNA pool, MP)和野生型DNA池(wild-type DNA pool, WP)。利用實(shí)驗(yàn)室已有的覆蓋玉米全基因組, 在B73和Mo17之間有多態(tài)性的432個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)這2個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。篩選在2個(gè)DNA池之間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記。通過Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)下載玉米基因組DNA序列, 并通過SSRHunter[24]開發(fā)SSR標(biāo)記; 驗(yàn)證在B73和Mo17之間具有多態(tài)性后用于的精細(xì)定位。

1.5 qRT-PCR

取B73根、莖、葉、未成熟雌穗(1~2 cm)和雄穗(1~2 cm)及12、14、16、18、20 DAP的未成熟籽粒和成熟籽粒, 迅速凍于液氮。提取總RNA, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA[25]。qRT-PCR (quantitative reverse transcription- PCR)中利用玉米基因作為內(nèi)參, 樣品間同一基因的相對(duì)表達(dá)量通過下例公式計(jì)算: 2-DDCt。

1.6 載體構(gòu)建及玉米遺傳轉(zhuǎn)化

通過對(duì)候選基因gDNA序列進(jìn)行分析, 選擇第2個(gè)外顯子的19 bp (5'-GCCGAG CTACCTCTGCGAC-3')的靶向序列。合成包括靶向序列和sgRNA在內(nèi)的寡核苷酸引物, 采用單編輯策略將該序列克隆到pCAMBIA3301-Cas9載體, 并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米未成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化, 獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株。通過測序來確定CRISPR/Cas9編輯玉米植株目標(biāo)位置附近的編輯位點(diǎn), 獲得5個(gè)獨(dú)立的CRISPR/ Cas9基因敲除轉(zhuǎn)基因株系, 選擇2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 基因注釋及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和MaizeGDB (https://maizegdb.org/)等數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站, 搜索下載相關(guān)基因的基因組、cDNA和蛋白序列。通過BLAST CD-Search (basic local alignment search toolconserved domain search, https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)比對(duì)分析目標(biāo)蛋白的保守序列。將所有進(jìn)行比對(duì)的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成FASTA格式合并導(dǎo)出, 通過CLUSTALW進(jìn)行多序列比分析, 在使用MEGA6進(jìn)行N-J (neighbor-joining)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.8 亞細(xì)胞定位

以玉米B73的12 DAP未成熟籽粒cDNA為模板, 通過PCR擴(kuò)增的全長CDS序列(除去終止密碼子)連接到pAN580載體, 構(gòu)建Dek54-GFP融合表達(dá)載體。將含有正確插入片段的載體和質(zhì)膜定位標(biāo)記載體PM107 (AtPIP1; 2-mCherry)分別通過PEG介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。在激光共聚焦顯微鏡(LSM800, Carl Zeiss)下觀察熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 dek54表型鑒定與遺傳分析

利用EMS化學(xué)誘變技術(shù)獲得了玉米籽粒缺陷突變體。該突變體與Mo17雜交, F1群體表型表現(xiàn)正常, 自交后F2果穗上產(chǎn)生分離(圖1-A)。統(tǒng)計(jì)5個(gè)F2果穗, 野生型(+/+和/+)與突變型(/)籽粒分別有1549粒和499粒, 適合度測驗(yàn)結(jié)果顯示, 野生型和突變體籽粒的分離比接近3∶1 (χ2= 0.16 < χ20.05= 3.84), 說明是一個(gè)單基因控制的隱性突變體。

與野生型相比表現(xiàn)為, 成熟籽粒變小, 皺縮干癟, 且顏色發(fā)白(圖1-A, B)。對(duì)野生型和成熟籽粒進(jìn)行徒手切片并在體式顯微鏡下觀察籽粒胚和胚乳的形態(tài)。籽?？v切面顯示, 突變體胚的形狀正常, 但顯著小于野生型(圖1-C), 突變體籽粒較野生型萌發(fā)延遲但后續(xù)生長正常(附圖1)。籽粒橫切面顯示, 突變體籽粒胚乳中間不透明的淀粉胚乳面積縮小, 分布在粉質(zhì)胚乳周圍的透明玻璃質(zhì)胚乳面積顯著增大(圖1-D)。野生型和的百粒重分別為31.2 g和10.0 g,僅為野生型的32.0%;十粒長和十粒寬分別為野生型的79.0%和66.7%, 均顯著低于野生型(圖1-E)。由此可見,突變顯著影響了籽粒胚和胚乳的發(fā)育。

2.2 dek54籽粒組織學(xué)觀察

取16 DAP的野生型和突變體籽粒進(jìn)行石蠟切片觀察。結(jié)果顯示,的種皮與胚乳脫離, 胚乳細(xì)胞相比野生型發(fā)生了明顯變化, 表現(xiàn)在糊粉層細(xì)胞相比野生型層數(shù)增加, 并且淀粉胚乳細(xì)胞組織形態(tài)不規(guī)則并且相比野生型排列較密且較小(圖2-A)。說明突變顯著地影響胚乳細(xì)胞的發(fā)育。推測由于胚乳細(xì)胞發(fā)育的不完全使得突變體籽粒表現(xiàn)出皺縮的表型。對(duì)成熟籽粒橫截面的掃描電鏡觀察顯示, 相同位置的野生型胚乳中淀粉粒周圍有密集的蛋白體包圍, 而突變體的淀粉周圍蛋白體數(shù)量較少, 且排列較疏松(圖2-B)。

A: 成熟果穗F2分離群體; B: 籽粒表型; C: 籽?？v切; D: 籽粒橫切; E: F2分離群體上野生型和突變體籽粒的百粒重、十粒長和十粒寬。標(biāo)尺為0.5 cm。Em: 胚; En: 胚乳; SE: 粉質(zhì)胚乳; VE: 玻璃質(zhì)胚乳。

A: F2segregating population of mature ear; B: phenotypes of kernels; C: cross section of kernels; D: longitudinally section of kernels; E: 100-kernel weight, ten-kernel length, and ten-kernel width of WT andmutant kernels from F2segregating population. Bar: 0.5 cm. Em: embryo; En: endosperm; SE: starchy endosperm; VE: vitreous endosperm.

A: 16 DAP野生型和突變體籽粒的石蠟切片縱切觀察。標(biāo)尺為100 μm。AL: 糊粉層; SE: 淀粉胚乳。B: 野生型和突變體成熟籽粒胚乳中心區(qū)域掃描電鏡觀察。標(biāo)尺為50 μm。SG: 淀粉粒; PB: 蛋白體。

A: longitudinal paraffin sections observation of developing WT andmutant kernels at 16 DAP. Bar: 100 μm. AL: aleurone layer; SG: starch endosperm. B: scanning electron microscopy observation of the central regions of WT andmutant mature kernel endosperm. Bar: 50 μm. SG: starch granule; PB: protein body.

2.3 dek54相關(guān)生化成分檢測

分別提取野生型和成熟籽粒胚乳中的總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白。結(jié)果顯示, 突變體的總蛋白和醇溶蛋白含量相比野生型分別降低了29.2%和27.6%, 而非醇溶蛋白沒有顯著差異(圖3-A)。成熟籽粒胚乳中的淀粉含量測定發(fā)現(xiàn), 突變體的胚乳淀粉含量與野生型沒有顯著差異(圖3-B)?？偘被岷繙y定顯示, 突變體籽粒胚乳中各類氨基酸含量相比野生型均顯著降低, 其中賴氨酸含量僅為野生型的63.0% (圖3-C)。進(jìn)一步全氮含量測定結(jié)果表明,突變體的成熟籽粒中全氮含量顯著低于野生型, 降低了16.5% (圖3-D)。

2.4 dek54突變體的精細(xì)定位

利用432個(gè)在B73和Mo17基因組間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記對(duì)突變體DNA池和野生型DNA池進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記umc2160在2個(gè)DNA池中檢測出多態(tài)性(圖4-A), 該標(biāo)記位于第7號(hào)染色體的7.01 bin。使用umc2160檢測33株的基因型, 結(jié)果顯示30株的基因型與表型相一致, 3株(17、25和27)因?yàn)槿旧w重組表現(xiàn)為雜合基因型(圖4-B), 由此證實(shí)了該標(biāo)記與基因連鎖。在umc2160標(biāo)記鄰近的區(qū)間開發(fā)新的SSR標(biāo)記(表1)用于定位。利用F2群體中1566個(gè)單株將初步定位在與SSR標(biāo)記SSR23403和SSR0308相鄰的8.52 Mb的物理區(qū)間內(nèi)(圖4-C)。進(jìn)一步通過重組植株的篩選, 開發(fā)并篩選到8個(gè)具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記。在SSR1~8標(biāo)記位置各篩選到交換單株20、11、11、3、2、2、2和11株。最終,定位在玉米7號(hào)染色體標(biāo)記SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb的區(qū)間內(nèi)(圖4-C)。

野生型和突變體成熟籽粒的蛋白(A)、淀粉(B)、各氨基酸組分(C)和全氮含量(D)。

Protein (A), starch (B), amino acid components (C), and total nitrogen contents (D) of WT andmutant kernels.

A: umc2160的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在WP和MP之間具有多態(tài)性; B: 通過33個(gè)單株的基因分型確定SSR連鎖標(biāo)記umc2160; C: 通過F2群體1566個(gè)單株對(duì)進(jìn)行精細(xì)定位。定位標(biāo)記SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb的區(qū)間內(nèi)。黑色垂直實(shí)線上方為分子標(biāo)記名稱, 下方數(shù)字為該標(biāo)記鑒定的交換單株數(shù)量。

A: the polymorphic PCR products amplified by umc2160 between WP and MP; B: confirmation of linkage SSR marker umc2160 by genotyping 33mutant plants; C: fine mapping ofusing F2population including 1566 individuals.was mapped to an interval about 290 kb flanked by SSR6 and SSR7. The symbols above and below the black vertical solid lines represent the molecular marker and the number of recombinants, respectively.

表1 dek54定位SSR標(biāo)記引物序列

表2 dek54定位區(qū)間基因注釋

2.5 候選基因序列及表達(dá)分析

Gramene玉米數(shù)據(jù)庫顯示SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb, 定位區(qū)間內(nèi)僅包括3個(gè)基因(表2), 通過擴(kuò)增并測序, 比較這3個(gè)基因在與對(duì)照B73的DNA序列, 發(fā)現(xiàn)基因第2個(gè)外顯子上第351個(gè)堿基位點(diǎn)由G突變轉(zhuǎn)換為A, 導(dǎo)致密碼子由TGG變?yōu)門AG, 從而造成蛋白翻譯的提前終止(圖5-A); 而其他2個(gè)基因的DNA序列沒有差異。因此推測基因的突變是導(dǎo)致表型產(chǎn)生的原因。

通過qRT-PCR的方法, 檢測基因在玉米自交系B73的不同組織的表達(dá)情況, 包括根、莖、葉、雄穗、花絲、12、14、16、18、20 DAP的未成熟籽粒和成熟籽粒。檢測表明,基因在未成熟籽粒(12~20 DAP)中特異性表達(dá); 且在12 DAP未成熟籽粒中表達(dá)量最高, 并隨著籽粒發(fā)育表達(dá)量逐漸下降, 在其他組織和成熟籽粒中均不能檢測到其表達(dá)(圖5-B)?；蛟谖闯墒熳蚜Ｖ械奶禺愋员磉_(dá)說明其在籽粒發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

2.6 CRISPR/Cas9靶向突變Zm00001d019294基因表型鑒定

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行靶向突變。以的第2個(gè)外顯子為靶標(biāo)設(shè)計(jì)sgRNA間隔序列。獲得了5個(gè)獨(dú)立的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因株系, 通過測序確定其中2個(gè)(和)含有由目標(biāo)序列插入或缺失引起的密碼子移位突變(圖6-A)。CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因株系的成熟籽粒與表現(xiàn)出相似的缺陷表型(圖6-B~D)。該結(jié)果表明基因是引起該籽粒突變表型的目標(biāo)基因。

A:基因結(jié)構(gòu)圖, 紅色箭頭所示為突變位點(diǎn); B:基因在不同組織及發(fā)育中的未成熟籽粒中的表達(dá)分析。

A: gene structure diagram of. The red arrow indicates mutation sites. B: the relative expression level ofin different tissues and developing immature kernel.

A:的CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)序列。sgRNA靶序列為綠色, PAM (protospacer-adjacent motif)序列為橙色, 紅色字母和短線分別代表插入和缺失; B:xMo17的F2成熟果穗; C: 成熟的WT和籽粒; D: 成熟的WT和籽粒的縱切。Em: 胚; En: 胚乳。標(biāo)尺為0.5 cm。

A: the sequence in thelocus targeted using CRISPR/Cas9. The sgRNA target sequence is green. Protospacer-adjacent motif (PAM) is blue. Red letters and dashes represent insertions and deletions, respectively. B: mature F2ear ofxMo17. C: mature WT andkernels. D: longitudinal paraffin sections of mature WT andkernels. Em: embryo; En: endosperm. Bars: 0.5 cm.

2.7 Dek54蛋白預(yù)測及亞細(xì)胞定位

()由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。的成熟轉(zhuǎn)錄本編碼序列長1923 bp, 編碼一個(gè)由640個(gè)氨基酸組成的蛋白。通過BLAST CD-Search比對(duì)分析該蛋白的保守序列, 結(jié)果表明, Dek54蛋白序列中包含MFS保守結(jié)構(gòu)域(圖7-A)。蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn), Dek54蛋白與玉米和擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體NRT1類蛋白具有較高的同源性, 且與ZmNRT1.5B和ZmNRT1.5A蛋白序列同源性最高(圖7-B)。通過PEG介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體共轉(zhuǎn)化及熒光顯微鏡觀察顯示, Dek54蛋白的綠色熒光與質(zhì)膜標(biāo)記蛋白紅色熒光完全重合(圖8), 表明Dek54定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。推測Dek54可能是一個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)膜的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。

Dek54-GFP載體與mCherry標(biāo)記的質(zhì)膜標(biāo)記(mCherry-PM; CD3-1007)共定位。標(biāo)尺為20 μm。

Dek54-GFP was co-localized with a mCherry-labeled plasma membrane marker (mCherry-PM; CD3-1007). Bar: 20 μm.

3 討論

籽粒缺陷(,)突變體是一類主要的玉米籽粒突變體。突變體表型變化極為顯著, 主要表現(xiàn)為, 胚乳發(fā)育缺陷、籽粒較小、種皮與胚乳分離、種皮顏色較淺, 且表面皺縮等特征[26]。本研究中,突變體具有突變體的典型表型特征, 其胚發(fā)育延遲, 胚乳發(fā)育不良; 相比野生型,籽粒的長、寬和粒重都顯著降低。是一個(gè)單基因控制的隱性突變體, 顯示為功能缺失突變。對(duì)玉米籽粒缺陷突變體進(jìn)行精細(xì)定位, 并通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變實(shí)驗(yàn)確定導(dǎo)致突變表型的基因。測序結(jié)果顯示,突變體在基因的第2個(gè)外顯子上有一個(gè)堿基突變導(dǎo)致該密碼子突變?yōu)榻K止子, 提前終止了蛋白序列。qRT-PCR結(jié)果表明,基因在未成熟籽粒中特異性表達(dá), 并隨著籽粒的發(fā)育表達(dá)降低, 且在成熟籽粒中不表達(dá)。說明基因在玉米籽粒發(fā)育過程中起著重要作用。

玉米中突變體種類多, 涉及的機(jī)制非常復(fù)雜。至今, 超過20個(gè)突變體已被鑒定。大部分突變體都是由PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白突變所引起[7,9-11,27-29]。PPR蛋白在線粒體和質(zhì)體中特異性作用于RNA編輯、剪輯、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等重要進(jìn)程[30], 但也有部分突變體不是PPR蛋白突變引起。例如Dek1編碼一個(gè)鈣蛋白酶家族蛋白, 影響籽粒胚和胚乳的糊粉層發(fā)育[3], 可能在陸地植物表面細(xì)胞位置傳感和信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮重要作用[31]; Dek15編碼一個(gè)黏連蛋白裝載復(fù)合體亞基, 決定染色體分離和籽粒發(fā)育[8]。本研究中,基因編碼一個(gè)含有MFS保守結(jié)構(gòu)域的蛋白。MFS是一類廣泛存在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族, 由協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體、共轉(zhuǎn)運(yùn)體和反向轉(zhuǎn)運(yùn)體共同組成, 能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多種底物包括無機(jī)和有機(jī)離子、核酸、氨基酸、短肽和脂類物質(zhì)[32], 在多種生理生化途徑中起著重要作用。所有的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體都具有一個(gè)典型的MFS折疊。這個(gè)折疊包含了2個(gè)結(jié)構(gòu)域, 每個(gè)結(jié)構(gòu)域都由6個(gè)連續(xù)的跨膜基序組成, 分別稱為N端和C端結(jié)構(gòu)域[33]。Dek1蛋白由一個(gè)多跨膜結(jié)構(gòu)域(mutispanning tranmembrane domain, MEM)組成[3]。序列分析發(fā)現(xiàn), MFS和DEK1-MEM的第16到22個(gè)跨膜基序具有相似性, 推測MFS蛋白在響應(yīng)化學(xué)滲透梯度促進(jìn)各種溶質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)墓δ? 與MEM感知相鄰細(xì)胞表面膜和外部環(huán)境差異方面功能的作用是相容的[4]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體NRT1是在高等植物中唯一具有典型的MFS結(jié)構(gòu)的蛋白[34]。由于對(duì)氨基酸殘基T101的磷酸化[35], 使得NRT1蛋白對(duì)硝酸根離子NO3-具有雙親和力, 即高親和力和低親和力[36]。其中, AtNRT1.5介導(dǎo)NO3-的外排, 并在將NO3-裝載進(jìn)入木質(zhì)部, 并轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分起著重要作用[37]。AtNRT1.8負(fù)責(zé)從根和木質(zhì)部中提取NO3-, 并與AtNRT1.5協(xié)同調(diào)控NO3-的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸[38]。將擬南芥和玉米的NRT1家族的蛋白以及Dek54蛋白進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)分析, Dek54與ZmNRT1.5B、ZmNRT1.5A、AtNRT1.5和AtNRT1.8分在一個(gè)組, 且具有最大的序列相似性。進(jìn)一步研究表明, Dek54蛋白定位在玉米原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)膜上。組織學(xué)觀察顯示,突變體籽粒淀粉胚乳細(xì)胞組織形態(tài)不規(guī)則, 并且相比野生型排列較密且較小, 胚乳中心區(qū)域的淀粉粒周圍的蛋白體相比野生型較小, 且數(shù)量較少。突變成熟體籽粒的總蛋白、醇溶蛋白、各類氨基酸及全氮含量均顯著低于野生型。推測突變體可能由于硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的缺失, 導(dǎo)致在玉米籽粒發(fā)育過程中不能有效的轉(zhuǎn)運(yùn)氮, 從而造成胚乳和胚的發(fā)育缺陷。但Dek54如何在玉米籽粒發(fā)育中發(fā)揮功能的具體作用機(jī)制仍然不明確。我們發(fā)現(xiàn)新的籽粒突變體豐富了玉米籽粒發(fā)育的研究材料, 為進(jìn)一步解析該基因在玉米籽粒發(fā)育過程的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過EMS化學(xué)誘變, 鑒定了一個(gè)新的玉米籽粒缺陷突變體。被定位在玉米7號(hào)染色體標(biāo)記SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb的區(qū)間內(nèi)。測序發(fā)現(xiàn)基因的第2個(gè)外顯子上第351個(gè)堿基由G突變轉(zhuǎn)換為A, 從而引起蛋白翻譯的提前終止, 并在玉米未成熟籽粒中特異性表達(dá)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變實(shí)驗(yàn)確定與突變表型相關(guān)的候選基因, 該基因編碼一個(gè)MFS家族蛋白并與ZmNRT1.5具有較高的同源性。此外, Dek54蛋白定位在玉米原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)膜上。突變體為解析玉米籽粒發(fā)育的分子機(jī)制提供了新的研究材料和理論依據(jù)。

[1] Sabelli P A, Larkins B A. The development of endosperm in grasses., 2009, 149: 14–26.

[2] Olsen O A. Endosperm development: cellularization and cell fate specification., 2001, 52: 233–267.

[3] Lid S E, Gruis D, Jung R, Lorentzen J A, Ananiev E, Chamberlin M, Niu X, Meeley R, Nichols S, Olsen O A. The() gene required for aleurone cell development in the endosperm of maize grains encodes a membrane protein of the calpain gene superfamily., 2002, 99: 5460–5465.

[4] Demko V, Perroud P F, Johansen W, Delwiche C F, Cooper E D, Remme P, Ako A E, Kugler K G, Mayer K F, Quatrano R, Olsen O A. Genetic analysis of DEFECTIVE KERNEL1 loop function in three-dimensional body patterning in., 2014, 166: 903–919.

[5] Becraft P W, Li K, Dey N, Asuncion-Crabb Y. The maizegene functions in embryonic pattern formation and cell fate specification., 2002, 129: 5217–5225.

[6] Tian Q, Olsen L, Sun B, Lid S E, Brown R C, Lemmon B E, Fosnes K, Gruis D F, Opsahl-Sorteberg H G, Otegui M S, Olsen O A. Subcellular localization and functional domain studies of DEFECTIVE KERNEL1 in maize andsuggest a model for aleurone cell fate specification involving CRINKLY4 and SUPERNUMERARY ALEURONE LAYER1., 2007, 19: 3127–3145.

[7] Qi W, Yang Y, Feng X, Zhang M, Song R. Mitochondrial function and maize kernel development requires, a pentatricopeptide repeat Protein involved in nad1 mRNA splicing., 2017, 205: 239–249.

[8] He Y, Wang J, Qi W, Song R. Maizeencodes the cohesin-loading complex subunit SCC4 and is essential for chromosome segregation and kernel development., 2019, 31: 465–485.

[9] Wang G, Zhong M, Shuai B, Song J, Zhang J, Han L, Ling H, Tang Y, Wang G, Song R. E+ subgroup PPR proteinis required for multiple mitochondrial transcripts editing and seed development in maize and Arabidopsis., 2017, 214: 1563–1578.

[10] Dai D, Luan S, Chen X, Wang Q, Feng Y, Zhu C, Qi W, Song R. Maizeencodes a P-type PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad2 intron 1 and seed development., 2018, 208: 1069–1082.

[11] Li X, Gu W, Sun S, Chen Z, Chen J, Song W, Zhao H, Lai J.encodes a PPR protein required for seed deve-lopment in maize., 2018, 60: 45–64.

[12] Qi W, Lu L, Huang S, Song R. Maizeencodes mitochondrial ribosomal protein L9 and is required for seed development., 2019, 180: 2106–2119.

[13] Wang G, Wang F, Wang G, Wang F, Zhang X, Zhong M, Zhang J, Lin D, Tang Y, Xu Z, Song R.encodes a myosin XI motor protein that is required for endoplasmic reticulum motility and protein body formation in maize endosperm., 2012, 24: 3447–3462.

[14] Schmidt R J, Burr F A, Burr B. Transposon tagging and molecular analysis of the maize regulatory locus., 1987, 238: 960–963.

[15] Schmidt R J, Burr F A, Aukerman M J, Burr B. Maize regulatory geneencodes a protein with a “l(fā)eucine-zipper” motif that binds to zein DNA., 1990, 87: 46–50.

[16] Myers A M, James M G, Lin Q, Yi G, Stinard P S, Hennen-Bierwagen T A, Becraft P W. Maizeencodes monogalactosyldiacylglycerol synthase and specifically affects galactolipids necessary for amyloplast and chloroplast function., 2011, 23: 2331–2347.

[17] Wang G, Sun X, Wang G, Wang F, Gao Q, Sun X, Tang Y, Chang C, Lai J, Zhu L, Xu Z, Song R.encodes an acyl-activating enzyme-like protein that affects storage protein synthesis in maize endosperm., 2011, 189: 1281–1295.

[18] Feng F, Qi W, Lü Y, Yan S, Xu L, Yang W, Yuan Y, Chen Y, Zhao H, Song R. OPAQUE11 is a central hub of the regulatory network for maize endosperm development and nutrient metabolism., 2018, 30: 375–396.

[19] Sarika K, Hossain F, Muthusamy V, Zunjare R U, Baveja A, Goswami R, Thirunavukkarasu N, Jha S K, Gupta H S., a high lysine and tryptophan mutant, does not influence the key physico-biochemical characteristics in maize kernel., 2018, 13: e0190945.

[20] Kim C S, Gibbon B C, Gillikin J W, Larkins B A, Boston R S, Jung R. The maizemutation is a deletion in the 16-kDa gamma-zein gene that induces the unfolded protein response., 2006, 48: 440–451.

[21] Kim C S, Hunter B G, Kraft J, Boston R S, Yans S, Jung R, Larkins B A. A defective signal peptide in a 19-kD alpha-zein protein causes the unfolded protein response and an opaque endosperm phenotype in the maizemutant., 2004, 134: 380–387.

[22] Holding D R, Otegui M S, Li B, Meeley R B, Dam T, Hunter B G, Jung R, Larkins B A. The maizegene encodes a novel endoplasmic reticulum protein involved in zein protein body formation., 2007, 19: 2569–2582.

[23] Coleman C E, Lopes M A, Gillikin J W, Boston R S, Larkins B A. A defective signal peptide in the maize high-lysine mutant., 1995, 92: 6828–6831.

[24] 李強(qiáng), 萬建民. SSRHunter: 一個(gè)本地化的SSR位點(diǎn)搜索軟件的開發(fā). 遺傳, 2005, 27: 808–810.

Li Q, Wan J M. SSRHunter: development of a local searching software for SSR sites., 2005, 27: 808–810.

[25] Zhou L, Zhou J, Xiong Y, Liu C, Wang J, Wang G, Cai Y. Overexpression of a maize plasma membrane intrinsic protein ZmPIP1;1 confers drought and salt tolerance in., 2018, 13: e0198639.

[26] Sheridan W F, Neuffer M G. Defective kernel mutants of maize: II. morphological and embryo culture studies., 1980, 95: 945–960.

[27] Zhu C, Jin G, Fang P, Zhang Y, Feng X, Tang Y, Qi W, Song R. Maize pentatricopeptide repeat protein DEK41 affects-splicing of mitochondrialintron 3 and is required for normal seed development., 2019, 70: 3795–3808.

[28] Ren R C, Wang L L, Zhang L, Zhao Y J, Wu J W, Wei Y M, Zhang X S, Zhao X Y. DEK43 is a P-type pentatricopeptide repeat (PPR) protein responsible for the-splicing ofin maize mitochondria., 2020, 62: 299–313.

[29] Dai D, Jin L, Huo Z, Yan S, Ma Z, Qi W, Song R. Pentatricopeptide repeat protein DEK46 is required for multi-sites mitochondrial RNA editing and maize seed development., 2020,

[30] Fujii S, Small I. The evolution of RNA editing and pentatricopeptide repeat genes., 2011, 191: 37–47.

[31] Liang Z, Demko V, Wilson R C, Johnson K A, Ahmad R, Perroud P F, Quatrano R, Zhao S, Shalchian-Tabrizi K, Otegui M S, Olsen O A, Johansen W. The catalytic domain CysPc of the DEK1 calpain is functionally conserved in land plants., 2013, 75: 742–754.

[32] Saier M H, Jr Reddy V S, Tamang D G, V?stermark A. The transporter classification database., 2014, 42: D251–258.

[33] Yan N. Structural biology of the Major Facilitator Superfamily transporters., 2015, 44: 257–283.

[34] Parker J L, Newstead S. Molecular basis of nitrate uptake by the plant nitrate transporter NRT1.1., 2014, 507: 68–72.

[35] Liu K H, Tsay Y F. Switching between the two action modes of the dual-affinity nitrate transporter CHL1 by phosphorylation., 2003, 22: 1005–1013.

[36] Liu K H, Huang C Y, Tsay Y F. CHL1 is a dual-affinity nitrate transporter of Arabidopsis involved in multiple phases of nitrate uptake., 1999, 11: 865–874.

[37] Lin S H, Kuo H F, Canivenc G, Lin C S, Lepetit M, Hsu P K, Tillard P, Lin H L, Wang Y Y, Tsai C B, Gojon A, Tsay Y F. Mutation of theNRT1.5 nitrate transporter causes defective root-to-shoot nitrate transport., 2008, 20: 2514–2528.

[38] Li J Y, Fu Y L, Pike S M, Bao J, Tian W, Zhang Y, Chen C Z, Zhang Y, Li H M, Huang J, Li L G, Schroeder J I, Gassmann W, Gong J M. Thenitrate transporter NRT1.8 functions in nitrate removal from the xylem sap and mediates cadmium tolerance., 2010, 22: 1633–1646.

附圖1 野生型和成熟籽粒的發(fā)芽測試(發(fā)芽后5 d)

Fig. S1 Germination test of wildtype andmature kernels (5 days after germination)

標(biāo)尺為1 cm。Bar: 1 cm.

Fine mapping and candidate gene analysis of maize defective kernel mutant

ZHOU Lian, LIU Chao-xian, CHEN Qiu-Lan, WANG Wen-Qin, YAO Shun, ZHAO Zi-Kun, ZHU Si-Ying, HONG Xiang-de, XIONG Yu-han, and CAI Yi-lin*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100087, China;2Beijing Engineering and Technique Research Center for Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Municipal Key Laboratory of the Molecular Genetics of Hybrid Wheat, Beijing 100097, China

Maize kernel is closely related to yield and nutritive quality. Study on the function of maize kernel development relative genes provides important basis for the molecular mechanism analysis, yield increasing and nutritive quality improving. B73 pollen was treated with ethyl methylmethanesulfonate (EMS) and a defective maize kernel() was screened.had small mature kernel, wrinkled and whitened seed coat phenotype. Genetic analysis indicated thatis a recessive mutant controlled by a single gene. Paraffin sections showed starchy endosperm cells ofhad irregular shape and dense arrangement at developmental stage. Scanning electron microscopy observation indicated that protein bodies around starch granules in the central region of themature kernel endosperm were fewer and arranged more loosely compare to wild type. Total protein, zein, amino acids components contents and total nitrogen content ofmature kernel were significantly lowered compared with the wild type.was located on chromosome 7 within the interval of the physical distance of about 290 kb between markers SSR6 and SSR7. Sequencing revealed that the 351th base G on the 2nd exon ofgene changed into A, which led to the premature termination of the protein translation.gene was specifically expressed in immature maize kernel, and has the highest expression in 12 DAP (days after pollination) immature kernel. Targeted mutation was performed using CRISPR/Cas9 system to identify that mutantphenotype was caused by candidate gene.encoded an MFS (major facilitator superfamily) protein and had high homology with ZmNRT1.5 (nitrate transporter). Besides, Dek54 protein was localized in the plasma membrane of maize protoplasts. The study oflaid the foundation for the molecular mechanism analysis of maize kernel development.

maize (L.);; kernel development; fine mapping

10.3724/SP.J.1006.2021.03060

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601312)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601312).

蔡一林, E-mail: caiyilin1789@163.com

E-mail:zhoulianjojo@swu.edu.cn

2020-10-15;

2021-01-13;

2021-03-02.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210301.1612.013.html