叢枝菌根真菌和糖醇螯合鈣對草莓采后果實硬度和細(xì)胞壁酶活性及其關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

屈 藝，曾 明，2

(1 西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶，400716；2 南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室，重慶，400716)

草莓果實色澤鮮艷、果香怡人、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富，含有多種對人體健康有益的生物活性物質(zhì)，如維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素、花色苷等，是深受消費者喜愛的小漿果，具有重要的經(jīng)濟價值[1]。但是，草莓果實柔軟、表皮嬌嫩，在采摘、貯藏、運輸、銷售過程中極易產(chǎn)生機械損傷，從而引發(fā)霉變和腐爛，進而造成經(jīng)濟損失，嚴(yán)重制約草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。因此，保持果實硬度、延長草莓貨架壽命是亟待解決的問題。

目前，草莓果實貯藏保鮮技術(shù)多種多樣，包括使用化學(xué)殺菌劑、涂膜、氣調(diào)貯藏、熱處理、紫外線輻射等，雖然有的保鮮技術(shù)能有效提高草莓的貯藏期，但存在成本高、技術(shù)復(fù)雜、對場地環(huán)境等因素要求嚴(yán)格等問題[3]。鈣是構(gòu)成細(xì)胞壁的重要元素，具有穩(wěn)固細(xì)胞壁、保持果實硬度的功能[4]。大量研究表明，合理施用鈣肥不僅能改善果實品質(zhì)，還能延長果實的貯藏期，維持果實的商品性。普通鈣鹽在植物體內(nèi)移動性較差，利用率不高，糖醇螯合鈣作為一種螯合態(tài)鈣，在植物體內(nèi)移動距離較長，是唯一能在植物韌皮部自由傳導(dǎo)的鈣，且本身無毒副作用，對植物與人體均無任何損傷，是一種良好的鈣肥補充劑[5]，近年來，在草莓[6]、茄子[7]、馬鈴薯[8]、皮球桃[9]等植物中均有報道。叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)廣泛分布于自然界土壤中，是一類重要的土壤微生物，能與約80%的陸生植物形成互惠共生關(guān)系[10]，提升植物對養(yǎng)分的吸收能力。已有研究表明，AMF共生可促進植物對鈣離子的吸收[11]，但AMF共生下施用糖醇螯合鈣是否能提升草莓果實硬度還較少報道。

本試驗以AMF的優(yōu)勢菌種摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)為對象，研究了接種或不接種AMF條件下，施用不同濃度糖醇螯合鈣溶液對草莓采后果實硬度、細(xì)胞壁酶活性變化以及果實軟化關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響，以期為菌根化草莓苗配合糖醇螯合鈣的合理施用濃度提供指導(dǎo)，為延長草莓貨架壽命提供另一種思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試宿主植物

“紅顏”草莓苗(Fragaria×ananassaDuch.)，購于重慶市渝北區(qū)海川草莓基地。

1.1.2 供試菌種與供試鈣肥

摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)，登錄號BGC XJ08A，購于北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所“中國叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫”(BGC)，菌劑包括基質(zhì)、孢子、根系和菌絲，活性孢子數(shù)量為70～80個/g。供試鈣肥為糖醇螯合鈣，其濃度經(jīng)測定為156.03 g/L，購于山東海岱綠洲生物工程有限公司。

1.1.3 基質(zhì)與容器

供試基質(zhì)為自配營養(yǎng)土(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石= 3∶1∶1，V/V/V)，泥炭土、珍珠巖和蛭石均購于重慶市江北區(qū)宏帆路宏帆望?；ǘ??；|(zhì)理化性質(zhì)為：pH值7.15，有機質(zhì)含量27.33 g/kg，全氮0.89 g/kg，全磷0.10 g/kg，全鉀0.35 g/kg，堿解氮30.10 mg/kg，速效磷228.64 mg/kg，速效鉀1 422.20 mg/kg，總鈣13.98 g/kg，水溶性鈣97.78 mg/kg，可交換鈣2 992.00 mg/kg?；|(zhì)經(jīng)0.11 Mpa，121 ℃高壓蒸汽滅菌2 h，殺死土著雜菌后攤晾備用。栽培容器為1.5加侖的塑料盆，規(guī)格為上內(nèi)口徑20 cm，下內(nèi)口徑16 cm，高度20 cm，栽培容器于0.1%高錳酸鉀溶液中浸泡24 h后晾干備用，每盆裝滅菌基質(zhì)約6 L。

1.2 試驗方法

試驗于2019年12月至2020年5月在西南大學(xué)園藝園林學(xué)院9號溫室進行，環(huán)境溫度、濕度、光照、水肥按照常規(guī)管理。

2019年12月8日挑選長勢相對一致的健康草莓苗定植，每盆1株。定植1個月后進行菌劑接種處理，每株接種5 g菌劑，對照以同量滅菌菌劑代替。

接種方法：在根際挖5個小坑，將菌劑分施其中。接種后統(tǒng)一常規(guī)水肥管理。3個月后進行澆灌鈣肥處理。

在綠果期、白果期和粉果期各澆灌1次糖醇螯合鈣溶液，以澆灌蒸餾水作為對照，每盆施用量為200 mL。

采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理18株，每小區(qū)6株，共計144株，重復(fù)3次。試驗設(shè)置8個處理，見表1。

表1 試驗處理

1.3 樣品采集及測定指標(biāo)

2020年5月21日采集果實，選擇九成熟、大小均勻、無機械損傷和微生物侵染的草莓果實用于采后貯藏試驗。將不同處理草莓果實分裝塑料盒中，每處理15個果實，貯藏在溫度(4±1) ℃，相對濕度50%～60%保持恒定的冷庫中，每4 d取樣1次，試驗至第12 d結(jié)束。

硬度采用GY-4-J型硬度計測定，每組測定5個果實，于果實赤道相對兩側(cè)各測定1次，重復(fù)測定3次，取其平均值，單位為kg/cm2。

采用DNS比色法測定多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性[12]，采用Zhou等[13]、Verma等[14]的方法稍作修改測定果膠甲酯酶(PME)活性，采用Langer等[15]的方法稍作修改測定β-半乳糖苷酶(β-Gal)的活性。

采用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(UNlQ-10 Column Trizol Total RNA Isolation Kit)提取草莓果實總RNA。定量PCR試劑為2X SG Fast qPCR Master Mix (High Rox，B639273，BBI，ABI)，定量PCR儀為StepOne Plus型熒光定量PCR儀 (ABI，F(xiàn)oster，CA，USA)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬度

試驗結(jié)果可以看出，與對照相比，單獨施用0.15%或0.20%的糖醇螯合鈣溶液或接種AMF聯(lián)合施用糖醇螯合鈣溶液均能顯著提升果實的硬度并延緩果實軟化。其中，F(xiàn)3(接種AMF聯(lián)合施用0.20%糖醇螯合鈣)處理效果最佳，相較于N0、F0、N3處理，草莓果實硬度分別提升了7.0%、7.1%、2.4%，說明接種AMF并施用0.20%糖醇螯合鈣溶液效果好于單獨施鈣處理和單獨接種處理，且糖醇螯合鈣濃度以0.20%的效果最佳(見圖1)。

從圖1中可以看出，隨著貯藏時間的不斷延長，草莓果實硬度呈不斷下降趨勢。在貯藏過程中，各處理的果實硬度均高于N0對照組，表明單獨施鈣處理和接種聯(lián)合施鈣處理均能延緩草莓果實的軟化。就減緩果實軟化的程度而言，單獨施鈣處理不如接種與施鈣結(jié)合處理的效果好。就糖醇螯合鈣施用濃度而言，單獨施鈣處理中，濃度為0.1%與0.15%之間差異不顯著；在接種與施鈣聯(lián)合的處理中，隨著糖醇螯合鈣濃度的增加，對果實硬度的增加作用和對果實軟化的延緩作用逐漸增強。至試驗結(jié)束時(采后第12 d)，N1、N2、 N3、F1、F2、F3處理的果實硬度較處理前分別下降了6.8%、9.4%、5.9%、3.1%、2.6%、2.2%，而對照組N0、F0的果實硬度分別下降了10.5%、10.2%，說明單獨施用糖醇螯合鈣、接種AMF并施用糖醇螯合鈣均能在貯藏期間有效保持草莓果實的硬度，延緩果實的軟化，延長貨架期，其中以接種AMF聯(lián)合施用0.20%糖醇螯合鈣溶液效果最好。

注：處理N0—N3，F(xiàn)0—F3詳見表1。圖2至圖6同。

2.2 細(xì)胞壁酶活性

試驗結(jié)果看出，貯藏期間草莓果實的PG、PME、β-Gal活性逐漸上升，在第12 d時各類酶活性達(dá)到最大，PG、PME活性在第12 d時上升較快。經(jīng)0.15%、0.20%糖醇螯合鈣單獨處理或鈣與AMF聯(lián)合處理的PG、PME、β-Gal活性均低于對照組。在試驗結(jié)束時，F(xiàn)3處理組的PG、PME、β-Gal活性分別是N0對照組的58.14%、70.07%、82.24%。結(jié)果表明，隨著貯藏時間的增加，特別是在貯藏第12 d，單獨施用0.15%或0.20%的糖醇螯合鈣、接種AMF并施用糖醇螯合鈣均抑制了PG、PME、β-Gal活性的上升，AMF和糖醇螯合鈣復(fù)合處理的抑制效果優(yōu)于單獨鈣處理，其中以0.20%的糖醇螯合鈣聯(lián)合AMF處理效果最明顯(見圖2至圖4)。

圖2 AMF和糖醇螯合鈣對“紅顏”草莓細(xì)胞壁多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的影響

圖3 AMF和糖醇螯合鈣對“紅顏”草莓細(xì)胞壁果膠甲酯酶(PME)活性的影響

圖4 AMF和糖醇螯合鈣對“紅顏”草莓細(xì)胞壁β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性的影響

2.3 關(guān)鍵基因相對表達(dá)量

2.3.1 總RNA的提取

圖5為草莓果實貯藏第12 d時總RNA的電泳檢測結(jié)果，條帶明亮、清晰，完整性較好。

注：Marker為DNA Marker，其只為檢測基因組污染，并不代表RNA條帶大小。

2.3.2FaPG1、FaβGal4基因表達(dá)

至試驗結(jié)束(采后貯藏第12 d)，與對照組N0相比，試驗組的FaPG1、FaβGal4基因表達(dá)量均得到了一定的抑制。未接種AMF條件下，施用0.15%、0.20%糖醇螯合鈣的FaPG1、FaβGal4基因表達(dá)量顯著降低。N2處理(單獨施用0.15%糖醇螯合鈣)的FaPG1、FaβGal4基因表達(dá)量分別比對照組N0降低39.72%、35.91%；N3處理(單獨施用0.20%糖醇螯合鈣)分別比對照組N0降低47.67%、50.20%。接種AMF條件下，隨著糖醇螯合鈣濃度的升高，對FaPG1、FaβGal4基因表達(dá)的抑制作用逐漸增強，其中，0.20%的糖醇螯合鈣聯(lián)合AMF處理的FaPG1、FaβGal4基因表達(dá)量分別比對照組F0降低58.67%、59.77%；比N3處理降低21.02%、19.21%。相較于對FaβGal4基因表達(dá)的抑制作用，AMF與糖醇螯合鈣的聯(lián)合作用對FaPG1基因表達(dá)的抑制作用更強(見圖6)。

圖6 AMF和糖醇螯合鈣對“紅顏”草莓FaPG1、FaβGal4基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗發(fā)現(xiàn)，不接種AMF時，單獨施用0.10%濃度的糖醇螯合鈣對草莓果實的硬度沒有顯著影響，同樣地，對多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲酯酶(PME)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)的活性也沒有顯著影響。0.15%、0.20%的糖醇螯合鈣可以增加果實硬度，延長貯期。在接種AMF條件下，對軟化和細(xì)胞壁酶活性的抑制情況表現(xiàn)為隨著糖醇螯合鈣濃度的升高，抑制作用越明顯。

細(xì)胞壁的成分由一系列細(xì)胞壁修飾酶催化，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲酯酶(PME)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和纖維素酶(Cx)等降解酶[16]。其中PG是果實軟化中最典型、最重要的酶之一，其作用于果膠分子，促使果膠降解、細(xì)胞壁解體，進而導(dǎo)致果實軟化。PME則和PG發(fā)生協(xié)同作用，催化果膠酯酸轉(zhuǎn)化為果膠酸，去酯化的果膠從而作為PG水解的底物[17]。β-Gal降解或溶解成熟果實細(xì)胞壁中的多糖，使細(xì)胞壁組分變得不穩(wěn)定，從而使細(xì)胞膨脹并發(fā)生軟化[18]。這些酶作為果實軟化研究中的熱點被廣泛關(guān)注，在多種水果中均有報道，如桃、葡萄、梨、蘋果、番茄、草莓等。糖醇螯合鈣作為一種新型鈣劑，能有效抑制細(xì)胞壁酶活性。裴健翔[19]以“寒富”蘋果為供試品種，在果實不同成熟時期噴施糖醇螯合鈣，發(fā)現(xiàn)與其他鈣劑相比，糖醇螯合鈣能顯著抑制細(xì)胞壁酶活性上升。本試驗以“紅顏”草莓為試材，設(shè)置了12 d的貯藏期限，每4 d觀察記錄一次，分階段觀察了草莓果實貯藏期間細(xì)胞壁酶活性的變化情況。結(jié)果表明，單獨施用0.15%、0.20%的糖醇螯合鈣或AMF配施糖醇螯合鈣均能達(dá)到抑制細(xì)胞壁酶活性的目的，從而延緩果實軟化，維持果實硬度，延長草莓貨架期，且聯(lián)合施用比單獨施鈣更有效。

為了進一步了解“紅顏”草莓果實的軟化，本試驗探究了果實軟化關(guān)鍵基因FaPG1、FaβGa4l的表達(dá)情況。試驗發(fā)現(xiàn)，貯藏期結(jié)束時，與對照相比，各處理草莓果實的兩種基因的表達(dá)均得到了抑制。PG作為影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的眾多酶中最重要的酶之一，其基因表達(dá)與草莓果實的軟化過程關(guān)系密切。Garcia-Cago[20]等人通過對草莓中的FaPG1和FaPG2進行沉默，研究表明，F(xiàn)aPG1在草莓軟化過程中的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化中起著至關(guān)重要的作用。在本次試驗中，F(xiàn)aPG1、FaβGa4l基因的表達(dá)趨勢分別與PG、β-Gal活性的變化一致，0.15%、0.20%糖醇螯合鈣的單獨施用或AMF配施糖醇螯合鈣有效抑制了FaPG1、FaβGa4l基因的表達(dá)，保持了草莓果實的硬度，依舊是AMF聯(lián)合施鈣比單獨施鈣更有效。本試驗僅重點關(guān)注了2個細(xì)胞壁酶活性相關(guān)基因的表達(dá)量，與細(xì)胞壁酶活性相關(guān)的其他基因的表達(dá)情況還需進一步探究。

綜上所述，接種AMF聯(lián)合施用糖醇螯合鈣能維持“紅顏”草莓采后果實硬度，抑制PG、PME、β-Gal活性，延緩軟化進程，延長貯期。糖醇螯合鈣與AMF配施的最佳濃度為0.20%。