長期定位不同施肥類型對煙田土壤nifH細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

蔣雨洲，陳順輝，李文卿*，劉青麗，李志宏，張云貴，張燕，唐英琪

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163391；

2 福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所，福州 350013；

3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081

生物固氮在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、環(huán)境保護和建立氮素生態(tài)平衡方面具有重要作用[1]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，每年由微生物介導(dǎo)的固氮量平均達90～130 Tg[2]。施肥年限、施肥類型和土壤本質(zhì)等因素，都會對土壤微生物活性、生物量和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響，最終表現(xiàn)為對農(nóng)田有害、有益和無影響的結(jié)果[3]。因此，研究土壤固氮微生物其群落結(jié)構(gòu)及其與施肥的關(guān)系，對于認識土壤氮素循環(huán)過程具有重要的意義。

固氮微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中十分重要的功能群之一，其數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)的變化，直接影響著土壤固氮效率高低和土壤氮素循環(huán)的運轉(zhuǎn)[4]。固氮微生物中廣泛存在編碼固氮酶含鐵蛋白的nifH基因，與生物固氮過程有著緊密的聯(lián)系[5-6]。Wakelin等[7]研究表明玉米秸稈回田可以顯著增加含nifH基因細菌的豐度，而氮肥的施用不會對其產(chǎn)生顯著影響；而劉樸方[8]認為，氮肥用量的增加會導(dǎo)致nifH基因豐度的降低，并影響含nifH基因細菌的群落結(jié)構(gòu)。Teng QH等[9]證實低量有機肥導(dǎo)致玉米土壤含nifH基因細菌多樣性增加。

稻草回田和餅肥施用是南方煙-稻輪作煙區(qū)的常用土壤保育措施，對提高土壤質(zhì)量，保障烤煙生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，有關(guān)施肥對土壤含nifH基因微生物群落影響的研究，主要集中在單一的施肥措施對微生物群落豐度、組成和多樣性的影響，而長期定位施用餅肥和稻草回田對煙田土壤中含nifH基因微生物群落豐度、組成和多樣性的影響，土壤中含nifH基因細菌的多樣性與無機氮含量之間的關(guān)系方面尚未見報道。本文主要通過研究土壤無機氮含量與硝化細菌種群和固氮細菌種群的偶聯(lián)關(guān)系，揭示農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用餅肥和稻草回田對煙田土壤無機氮含量及nifH細菌多樣性的影響，旨在為煙田建立科學(xué)的施肥制度，提高土壤質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和品種

試驗在福州市晉安區(qū)宦溪鎮(zhèn)福建省煙草科學(xué)研究所科研基地進行。2008 年水稻收割后試驗田 0～20 cm耕層土壤基本養(yǎng)分較為一致，養(yǎng)分含量分別為：有機質(zhì) 28.96 g/kg，堿解氮 144.66 mg/kg，速效磷 5.85 mg/kg，速效鉀 142.43 mg/kg，pH 5.76。土壤類型為沙壤土。2009 年開始進行定位施肥處理。供試烤煙品種為翠碧 1 號。

1.2 試驗設(shè)計

試驗從 2009 年烤煙生產(chǎn)季開始，2008年水稻收割后將田塊分成 3 個小區(qū)，每個小區(qū) 350 m2。試驗共設(shè)置3 個處理，分別為：T1：常規(guī)施用化肥對照處理，每年水稻收割后將稻草清除出田；T2：常規(guī)施用化肥+稻草回田處理，在 T1 處理施肥的基礎(chǔ)上，每年水稻收割后，將稻草粉碎后回田處理；T3：常規(guī)施用化肥+稻草回田+餅肥處理， 在 T2 處理的基礎(chǔ)上，移栽前施條溝肥時增加施用餅肥 300 kg/hm2。各處理均不設(shè)重復(fù)。

1.3 田間管理

各處理每年晚稻收割后均進行溶田。每個處理2009—2013年烤煙生產(chǎn)季施用90 kg/hm2。化肥氮，N：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；2014—2017年 烤煙生產(chǎn)季施用97.5 kg/hm2化肥氮，N：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；（肥料分別為煙草專用肥N：P2O5：K2O＝12：8：22，復(fù) 合 肥N：P2O5：K2O＝15：15：15；硝酸鉀N：P2O5：K2O＝13：0：38和硫酸鉀含K2O 51%）；基肥：追肥=60：40。試驗當季施用餅肥全氮含量3.91%，全磷含量10.7 g/kg，全鉀含量11.92 g/kg；稻草全氮含量8.55 g/kg，全磷含量1.55 g/kg，全鉀含量15.36 g/kg。每年水稻季N用量為96.3 kg/hm2，P2O5用量為70.5 kg/hm2的和K2O用量為26.25 kg/hm2，肥料種類分別為碳銨、過鈣（有效磷≥12%）、復(fù)合肥（N：P2O5：K2O＝15：15：15）和水稻專用肥（N：P2O5：K2O＝12：6：7）。

1.4 樣品采集

1.4.1 土壤理化性質(zhì)測定樣品采集

2017 年烤煙施肥移栽前，各小區(qū)按梅花 5 點取0～20 cm 耕層土壤混合樣，剔除雜質(zhì)后過 5 mm 篩，風(fēng)干待測定土壤常規(guī)理化性質(zhì)。6 月 30 日煙葉采收結(jié)束后每處理距離煙株 15 cm 處取 3 個煙畦縱切面土壤（2 cm 厚度）混合樣， 風(fēng)干后測定化學(xué)成分。

1.4.2 土壤細菌多樣性測定樣品采集

在 2017 年 6 月 15 日，烤煙收獲季，取煙株根際土壤，每個處理小區(qū)各取樣 3 次重復(fù)，剔除雜質(zhì)后并過 2 mm 篩，裝于封口袋冷凍保存，進行功能基因多樣性分析。

1.5 樣品的測定

土壤理化性質(zhì)測定：土壤NO3--N含量和NH4+-N含量采用0.01 mol/L無水氯化鈣浸提，德國默克公司生產(chǎn)的Reflectoquant試劑盒測定。

土壤細菌DNA提取，PCR擴增和Miseq測序：采集的土壤樣品送至北京奧維森基因科技有限公司利用Illumina Miseq PE300平臺進行測序分析。采用PowerSoil?DNA Isolation kit (MO BIO Laboratories,Inc., CA, USA）試劑盒，按操作步驟說明提取土壤DNA。用1%瓊脂糖凝膠進行檢測DNA提取質(zhì)量和濃度。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶8-bp Barcode的特異引物，進行PCR反應(yīng)。nifH上游引物為AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC，nifH下游引物為TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)32次，循環(huán)結(jié)束后72℃保持7 min，4℃條件下結(jié)束，收集數(shù)據(jù)。將同一樣本3次PCR反應(yīng)產(chǎn)物的混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）定量檢測，最后按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合?；旌虾蟮臉悠愤M行Miseq測序，測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（SRA accession: PRJNA542599）。測定樣品時，標準品與未知樣品同時進行PCR循環(huán)，PCR反應(yīng)體系配置如下：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，10 mmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，加水至18 μL。加入2 μL DNA后，按以下程序進行PCR：95℃，30 s；40個PCR循環(huán)（95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光））結(jié)合標準曲線計算獲得待測樣品中nifH基因拷貝數(shù)。

1.6 計算方法和數(shù)據(jù)分析

生物信息學(xué)分析等由北京奧維森基因科技有限公司完成，原始數(shù)據(jù)下機后，首先進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優(yōu)化序列，然后進行OTU聚類及注釋，其中OTU劃分基于核苷酸序列97%相似性水平。

不同處理對土壤nifH基因拷貝數(shù)、Alpha多樣性的影響采用SAS package 9.1（SAS Institute，Cary，NC，USA）進行ANOVA分析，LSD（P＜0.05）進行差異比較；進化發(fā)生樹通過MAFFT進行序列對齊，F(xiàn)astTree進行建樹，并根據(jù)R語言把其物種的豐度和進化關(guān)系進行可視化展示；Venn圖通過R語言工具統(tǒng)計和作圖。

試驗數(shù)據(jù)經(jīng) EXCEL 2010 整理后作圖，并用SPSS 11.5 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期定位施肥對土壤無機氮的影響

由圖 1 可見，經(jīng)過連續(xù) 8 年的定位施肥的試驗地，烤煙采收后常規(guī)施用化肥的土壤T1處理和施用化肥+稻草回田的土壤T2處理的無機氮含量均高于移栽前土壤，而施用化肥+稻草回田+餅肥的土壤T3處理則反之；3 個處理烤煙移栽前和采收后的土壤無機氮含量，均以T3處理最高，分別為46.6 mg/kg和25.5 mg/kg，與同時期T1和T2處理間均呈顯著性差異，但在移栽前T2處理的土壤無機氮含量高于T1處理，兩處理間無顯著性差異，而采收后T2低于T1處理土壤無機氮含量，兩處理間無顯著性差異。說明在稻草回田基礎(chǔ)上再添加餅肥，能夠提高煙田土壤無機氮含量。

圖1 不同施肥處理煙田土壤無機氮含量Fig.1 Inorganic nitrogen contents in tobacco planting soil treated with different fertilization scheme

2.2 長期定位施肥對煙田土壤含nifH基因細菌α多樣性的影響

如圖 2所示，與長期單一施化肥的 T1 處理相比，稻草回田 T2 處理降低了煙田土壤中chao1指數(shù)，而增加餅肥的 T3 處理提高了煙田土壤中chao1指數(shù)，各處理間均無顯著性差異。各處理的PD_whole_tree指數(shù)變化規(guī)律與chao1指數(shù)較為相似，T3處理最高，其次是T1 處理，而T2 處理最低。說明在稻草回田基礎(chǔ)上增施餅肥有利于提高煙田土壤細菌的豐富度和譜系多樣性。與長期單一施化肥的 T1 處理相比，稻草回田 T2 處理能夠提高煙田土壤中shanoon指數(shù)，而再增施餅肥的 T3 處理可進一步提高煙田土壤中shanoon指數(shù)， T3 處理分別與T1和T2處理間呈顯著性差異。從observed_species來看，各處理實際觀測到OTU的個數(shù)變化規(guī)律與shanoon指數(shù)相似，T3處理最高，其次是T2處理，而T1 處理最低。說明在稻草回田基礎(chǔ)上增施餅肥有利于提高煙田土壤細菌多樣性。

2.3 長期定位施肥對煙田土壤中含nifH基因細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

如圖 3 可知，3 個處理共測得 2003 個 OTU。T1和 T3處理的共有 OTU 個數(shù)最多，為 100 個；其次是T2 和 T3 處理的共有 OTU 個數(shù)為99個，而T1 和T2 處理的共有 OTU 個數(shù)最少，為98個。T2 處理獨有 OTU 個數(shù)最少，為 18 個；其次是T1 處理的獨有OTU 個數(shù)為19個，而T3 處理的獨有 OTU 個數(shù)最高，為34個。說明煙-稻輪作體系下，長期稻草回田后加施餅肥均對土壤獨有細菌種類的影響較小。

2.4 不同施肥處理的土壤nifH細菌OTU差異

各處理的OTU差異反映在二維坐標圖上，處理組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。如圖4所示，各處理的3次重復(fù)分布較為集中，處理間差異明顯。其中PC1因子的影響達62.16%，PC2因子影響為18.62%，兩者影響合計為80.78%。T1 處理位于橫坐標-0.2附近，縱坐標0～0.1的區(qū)間內(nèi)；T2處理位于橫坐標-0.1～0和縱坐標-0.1以下的區(qū)間內(nèi)；T3處理位于橫坐標0.15～0.2和縱坐標0～0.1的區(qū)間內(nèi)。從各處理所在區(qū)間距離來看，T1 處理與T3處理在橫坐標（PC1影響因子）的距離最遠，并且高于T1 處理與T2處理和T2處理與T3處理，均約為2倍；從PC2影響因子看T1處理和T3處理差異較小，均與T2處理有較大的差異。說明在試驗不同施肥類型主處理影響因子下，T1與T3處理對含nifH基因細菌影響的差異較大，T2處理居于兩者中間；在PC2影響因子（定位施肥時間）影響下，T2處理與T1和T3處理的差異逐漸增大。

圖 2 不同施肥處理煙田土壤中細菌 α 多樣性分析Fig.2 Bacterial α-diversity in tobacco field soil treated with different fertilization scheme

圖3 不同施肥處理煙田土壤中含nifH 基因細菌OTU 數(shù)的Venn 圖Fig.3 Venn of nifH bacteria OTUs in tobacco field soil treated by different fertilization

2.5 不同施肥處理的含nifh基因細菌進化分支圖

圖4 不同施肥處理的土壤nifH細菌OTU差異Fig.4 Difference in OTU of soil nifH bacteria under different fertilization scehme

如圖 5 可知，不同施肥處理對煙田土壤細菌進化分支有著不同的影響，從門至屬的分類級別由輻射的圓圈內(nèi)至外，著色為黃色的無顯著差異物種所占比例較高，與之相比各處理中體現(xiàn)各自差異的細菌類群較少。各處理中在進化分支圖明顯體現(xiàn)的細菌在門水平未出現(xiàn)，T1 處理在進化分支圖明顯體現(xiàn)的細菌在綱水平未出現(xiàn)；在目水平包括Gallionellales；在科水平包括Phyllobacteriaceae、Desulfohalobiaceae和Gallionellaceae等。T2處理在進化分支圖明顯體現(xiàn)的細菌在綱水平包括Alphaproteobacteria；在目水平包括Rhizobiales；在科水平包括Bradyrhizobiaceae和Oxalobacteraceae等。T3 處理在進化分支圖明顯體現(xiàn)的細菌在綱水平未出現(xiàn)；在目水平包括Caulobacterales；在科水平包括Caulobacteraceae和Chloroflexaceae等。從而說明，單施化肥的煙田和化肥＋稻草回田+增施餅肥處理的煙田細菌在綱水平未出現(xiàn)顯著的優(yōu)勢種群，而化肥＋稻草回田處理的煙田細菌在綱、目、科屬水平均有較多的優(yōu)勢種群。

圖5 不同施肥處理的土壤含nifH基因細菌 LEf Se 進化分支圖Fig.5 LEf Se of soil nifH bacteria under different fertilization scheme

2.6 長期定位施肥對煙田土壤中含nifH基因細菌組成的影響

試驗的3個處理共鑒定出17個門、23個綱、55個目、97個科、175個屬。從表1可見，所占比例較高（相對豐度＞0.5%）的5個菌門，依 次 分 別 為Proteobacteria＞Cyanobacteria＞Verrucomicrobia＞Actinobacteria＞Spirochaetes，分 別 介 于80.01%～82.36%、33.24%～4.36%、3.15%～3.58%、3.49%～4.72%和0.48%～1.08%之間，以Proteobacteria最高，介于80.01%～82.36%之間。T1處理Proteobacteria的相對豐度為80.21%，T3處理比T1處理減少了0.25%，T2處理比T1處理增加了2.68%，且顯著高于其它兩個處理。

所占比例較高（相對豐度＞0.5%）的7個菌綱，依次分別為Alphaproteobacteria＞Deltaproteobacteria＞Betaproteobacteria＞Gammaproteobacteria＞Opitutae＞Actinobacteria＞Spirochaetia，分 別 介 于32.16%～36.02%、26.62%～27.90%、12.93%～16.09%、4.86%～5.34%、3.15%～3.58%、3.49%～4.72%和0.48%～1.08%之間，主要的4個菌綱：Alphaproteobacteria的相對豐度T1處理為32.16%，顯著低于其它兩個處理，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.00%和7.45%；Deltaproteobacteria的相對豐度T1處理為26.62%，T2和T3處理分別比T1處理增加了4.81%和3.92%，三個處理間差異不顯著；Betaproteobacteria的相對豐度T1處理為16.09%，T2和T3處理分別比T1處理顯著減少了18.19%和19.63%；Gammaproteobacteria的相對豐度T1處理為5.34%，T2和T3處理分別比T1處理減少了1.21%和9.01%，三個處理間差異不顯著。

所占比例較高（相對豐度＞0.5%）的12個菌目，依 次 分 別 為Rhizobiales ＞ Desulfovibrionales ＞Gallionellales ＞ Desulfuromonadales＞ Rhodocyclales＞ Nostocales ＞ Opitutales ＞ Burkholderiales ＞Myxococcales ＞ Frankiales ＞ Desulfobacterales ＞Methylococcales， 分 別 介 于31.32%～35.29%、14.16%～14.95%、6.02%～9.46%、6.64%～7.30%、3.44%～4.01%、2.27%～3.37%、3.14%～3.58%、2.62%～3.39%、2.93%～3.22%、3.34%～4.51%、1.93%～2.03%和1.61%～1.95%之間，主要的4個菌目：Rhizobiales的相對豐度T1處理為31.32%，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.67%和7.74%，差異達到顯著水平；Desulfovibrionales的相對豐度T1處理為14.16%，T2和T3處理分別比T1處理增加了5.54%和0.77%，處理間差異不顯著；Gallionellales的相對豐度T1處理為9.46%，T2和T3處理分別比T1處理減少了26.37%和36.30%，降幅達到顯著水平；Desulfuromonadales的相對豐度T1處理為6.64%，T2和T3處理分別比T1處理增加了8.49%和10.03%，處理間差異不顯著。

所占比例較高（相對豐度＞0.5%）的12個菌科，依次分別為Bradyrhizobiaceae ＞ Desulfovibrionaceae＞ Gallionellaceae ＞ Geobacteraceae ＞ Rhodocyclaceae＞ Opitutaceae ＞ Nostocaceae ＞ Anaeromyxobacteraceae＞ Frankiaceae ＞ Methylococcaceae ＞ Methylocystaceae＞ Desulfobulbaceae，分 別 介 于28.12%～31.68%、13.18%～14.18%、6.02%～9.46%、6.37%～7.12%、3.44%～4.01%、3.14%～3.58%、1.97%～2.95%、2.92%～3.20%、3.34%～4.51%、1.61%～1.95%、1.60%～2.07%和1.22%～1.33%之 間，主 要 的4個菌科：Bradyrhizobiaceae的相對豐度T1處理為28.12%，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.66%和7.70%，T1處理和T2處理差異達到顯著水平；Desulfovibrionaceae的相對豐度T1處理為13.18%，T2和T3處理分別比T1處理增加了7.63%和3.20%，處理間差異不顯著；Gallionellaceae的相對豐度T1處理為9.46%，T2和T3處理分別比T1處理減少了26.37%和36.30%，降幅達到顯著水平；Geobacteraceae的相對豐度T1處理為6.37%，T2和T3處理分別比T1處理增加了9.38%和11.87%，三者差異不顯著。

所占比例較高（相對豐度＞0.5%）的14個菌屬，依次分別為Bradyrhizobium ＞ Desulfovibrio＞ Sideroxydans ＞ Geobacter＞ Anaeromyxobacter＞ Frankia ＞ Azospira ＞ Nostoc ＞ Methylocystis＞ Azoarcus ＞ Desulfobulbus ＞ Spirochaeta ＞Pseudacidovorax ＞ Methylococcus， 分 別 介 于27.96%～31.56%、13.18%～14.18%、6.02%～9.46%、6.37%～7.12%、2.92%～3.20%、3.34%～4.51%、1.30%～1.82%、0.66%～1.84%、1.60%～2.07%、1.50%～1.58%、1.08%～1.22%、0.45%～1.-03%、0.68%～1.03%和0.97%～1.10%之間，主要的4個菌屬：Bradyrhizobium的相對豐度T1處理為27.96%，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.88%和7.62%，T2處理和T1處理間差異達到顯著水平；Desulfovibrio的相對豐度T1處理為13.18%，T2和T3處理分別比T1處理增加了7.63%和3.20%，處理間差異不顯著；Sideroxydans的相對豐度T1處理為9.46%，T2和T3處理分別比T1處理減少了26.37%和36.30%，降幅達到顯著水平；Geobacter的相對豐度T1處理為6.37%，T2和T3處理分別比T1處理增加了9.38%和11.87%，處理間差異不顯著。屬水平的細菌豐度在1%以上的有10個，分別 為Bradyrhizobium、Desulfovibrio、Sideroxydans、Geobacter、Anaeromyxobacter、Frankia、Azospira、Methylocystis、Azoarcus和Desulfobulbus。

表1 不同施肥處理對煙田土壤中含nifH基因細菌的組成與土壤無機氮含量Pearson相關(guān)性分析Tab. 1 Pearson correlation between relative abundance of nifH bacteria and inorganic nitrogen contents uin tobacco planting soil treated different fertilization scheme

續(xù)表1

2.7 相關(guān)性分析

表1所示，煙田土壤中含nifH基因細菌組成與土壤無機氮Pearson相關(guān)性分析，土壤中細菌門水平組成中Verrucomicrobia 和Acidobacteria相對豐度均與土壤無機氮呈極顯著正相關(guān)；土壤中細菌門水平組成中Proteobacteria和Spirochaetes相對豐度分別與土壤無機氮呈顯著負相關(guān)。土壤中細菌綱水平組成中Opitutae和Actinobacteria相對豐度均與土壤無機氮呈極顯著正相關(guān)；土壤中細菌綱水平 組 成 中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Spirochaetia相對豐度，均與土壤無機氮呈負相關(guān)，其中Gammaproteobacteria相對豐度與土壤無機氮呈極顯著負相關(guān)，Spirochaetia相對豐度與土壤無機氮呈顯著負相關(guān)。土壤中細菌目水平組成中Desulfovibrionales和Gallionellales相對豐度，均與土壤無機氮呈顯著負相關(guān)；土壤中細菌目水平組成中Opitutales、Burkholderiales、Myxococcales、Frankiales和Methylococcales相對豐度，均與土壤無機氮呈極顯著正相關(guān)，Desulfobacterales相對豐度與土壤無機氮呈顯著正相關(guān)。土壤中細菌科水平組成中Gallionellaceae、Methylocystaceae和Desulfobulbaceae相對豐度，均與土壤無機氮呈顯著負相關(guān)；土壤中細菌科水平組成中Opitutaceae、Anaeromyxobacteraceae、Frankiaceae和Methylococcaceae相對豐度，均與土壤無機氮呈極顯著正相關(guān)。土壤中細菌屬水平組成中Sideroxydans、zospira、Nostoc、Methylocystis、Desulfobulbus、Spirochaeta和Methylococcus相對豐度均與土壤無機氮呈顯著負相關(guān)，土壤中細菌屬水平組成中Anaeromyxobacter和Frankia相對豐度，均與土壤無機氮呈極顯著正相關(guān)。

3 討論

土壤微生物在土壤中參與有機質(zhì)和各種養(yǎng)分的分解與轉(zhuǎn)化，與土壤肥力高低密切相關(guān)，而土壤細菌是土壤微生物的主要組成部分[10-11]。長期施用餅肥并覆蓋稻草，可有效增加土壤養(yǎng)分有效性[12]。本試驗結(jié)果表明，長期稻草回田并施用餅肥有利于提高烤煙土壤無機氮含量；而單獨稻草回田可能因稻草碳/氮比較高，回田后在土壤中分解過程中還消耗土壤中的氮，導(dǎo)致煙葉采收結(jié)束時土壤無機氮含量較低。

蔣雨洲等[13]研究結(jié)果表明在東北黑土的長期定位試驗條件下，土壤微生物多樣性受施肥類型的影響，與施加有機肥處理相比，單施化肥處理的土壤微生物多樣性略低。從本研究的各處理獨有OTU個數(shù)看，T3處理最高，為34個，而T1和T2處理分別為18和19個。由于土壤細菌群落結(jié)構(gòu)易受有機肥料的影響，煙田施入有機肥導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)和微生物活性改變，從而改變了微生物群落多樣性[14-15]。近年來，丁建莉等[16]研究結(jié)果表明在東北黑土的長期定位試驗條件下，土壤微生物多樣性受施肥類型的影響，施用有機肥比單施化肥的土壤微生物多樣性較高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與施用化肥農(nóng)田相比，增施餅肥對聚類影響較大，與前人研究結(jié)果一致。

生物固氮是指在固氮微生物的作用下將空氣中的氮氣還原成氨的過程，是大氣氮素進入生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的主要途徑之一，土壤中古菌和細菌等多種類群都有固氮能力[17]。有研究表明，氮肥和有機肥施用影響土壤固氮微生物的群落組成[18-19]。有研究指出，施肥不會引起固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化[20]。從本研究細菌nifH基因α多樣性看，在稻草回田基礎(chǔ)上并添加餅肥有利于提高煙田土壤細菌豐富度和譜系多樣性，這與TIAN等[21]研究結(jié)果較為一致?？赡苁且驗橛袡C物料還田為微生物代謝提供更多可供分解的植物殘體，進而促進了土壤微生物活性，而且有機肥物料本身也帶入大量活的微生物，所以增加了土壤微生物的豐富性[22]，但還需進一步深入探究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單施化肥相比，稻草回田處理和稻草回田配施餅肥處理，煙田土壤含nifH基因細菌α 多樣性均有提高，而稻草回田配施餅肥處理最有利于提高煙田土壤中shanoon指數(shù)和實測的OTU個數(shù)。由于稻草回田增加了土壤有機質(zhì)和有效養(yǎng)分含量[23-24]，能為固氮微生物特別是異養(yǎng)固氮微生物的生長和代謝提供物質(zhì)和能量來源，從而有益于固氮微生物的繁殖[25-26]，而稻草回田后并配施餅肥，能進一步提供豐富的碳源及其他營養(yǎng)元素，進而促進土壤固氮微生物的大量繁殖[27-28]，而單一施肥會導(dǎo)致微生物多樣性降低[29]，Zhou等[30]研究長期單施化肥對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響指出，單施化肥會減少細菌種群的豐度，而化肥與有機肥或綠肥秸稈長期配合施用，可改良土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤微生物的數(shù)量[31]。

Roesch等[32]研究證實農(nóng)田土壤細菌多樣性主要為豐度最高的Proteobacteria菌屬，而本研究結(jié)果與之較為一致，但與前人研究所涉及細菌群落結(jié)構(gòu)和豐度相比較，本研究所針對的微生物組成中，不同的菌種與土壤化學(xué)性質(zhì)有著密切的關(guān)系，土壤中細菌豐富度受有機質(zhì)含量的影響[33]，Proteobacteria（變形菌門）與土壤速效養(yǎng)分關(guān)系密切[34]，這可能稻草回田過程中稻草未徹底腐爛，在煙株生長期間繼續(xù)分解的過程中仍然消耗一定的土壤氮，稻草回田處理Proteobacteria的相對豐度最高，在烤煙移栽前，處理間土壤無機氮的含量與Proteobacteria的相對豐度表現(xiàn)較一致，與前人研究結(jié)果相似，但在烤煙采收后，土壤無機氮的含量與Proteobacteria的相對豐度表現(xiàn)相反，可能是由于采收后烤煙根系分泌物的影響所致[35]，其原因還需進一步探究。本研究進一步明確Cyanobacteria（藍細菌）豐度次之，而且Cyanobacteria與腐殖質(zhì)的形成密切相關(guān)[36]，由于腐殖質(zhì)是土壤有機質(zhì)重要組分之一，稻草回田及有機肥的投入都會增加土壤中有機質(zhì)含量，從而提高土壤肥力[37]；Verrucomicrobia、Actinobacteria和Spirochaetes的相對豐度＞0.5%，Verrucomicrobia（疣微菌）是一種纖維素降解菌，有利于植物殘體在土壤中的分解，提高土壤肥力[38]，因此，本研究中增施餅肥的T3處理Verrucomicrobia的相對豐度最高；Actinobacteria（放線菌）能夠起到病害生物防治的作用，農(nóng)田施肥可以向土壤中輸入養(yǎng)分，刺激微生物生長繁殖，從而影響土壤微生物的豐度、活性、微生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)[39-40]，而農(nóng)田施入有機肥還能夠改良土壤理化性質(zhì)，促進有益菌生長[41]，因此，本研究中隨著有機肥量的增多呈現(xiàn)出Actinobacteria豐度較高的趨勢。

本研究通過LEf Se進化分支圖還發(fā)現(xiàn)，在煙田細菌目水平組間差異相比，各處理中單施化肥、稻草回田和增施餅肥的煙田細菌目水平組間差異較高的分別是Gallionellales（披毛菌目）、Rhizobiales（根瘤菌目）和Caulobacterales（柄桿菌目）有關(guān)目的物種。由于Gallionellales（披毛菌目）參與Fe的轉(zhuǎn)化[41]，與固氮方面沒有直接聯(lián)系，而Rhizobiales（根瘤菌目）在土壤中長期以腐生菌的狀態(tài)存在，起到固氮作用[42]， Caulobacterales（柄桿菌目）有利于物料的分解[43]，且能與根瘤菌協(xié)同作用，聯(lián)合固氮，增強土壤生物固氮，從而提高土壤肥力[44]，而本研究中稻草回田后并配施餅肥的煙田，在烤煙移栽前和采收后的土壤無機氮含量均最高，與該理論一致。

4 結(jié)論

（1）不同施肥類型對植煙土壤無機氮含量有著不同的影響，稻草回田和稻草回田并添加餅肥能夠改善植煙土壤無機氮含量，稻草回田并添加餅肥更有利于提高土壤無機氮含量。

（2）不同施肥類型對土壤nifH基因細菌的獨有OTU 個數(shù)影響較小，但與單施化肥相比，稻草回田或再增加餅肥有利于提高α 多樣性。

（3）不同施肥類型對植煙土壤微生物組成的影響，細菌所占比例較高的主要1個菌門，Proteobacteria，而Proteobacteria 菌門和菌門下物種的相對豐度最高，其中與單施化肥相比，稻草回田的植煙土壤 Proteobacteria 菌門相對豐度高。

（4）不同施肥類型對植煙土壤微生物 LEf Se 進化分支圖有明顯影響，單施化肥的煙田土壤細菌表現(xiàn)優(yōu)勢的細菌種群主要是Gallionellales（披毛菌目）及其目下的細菌種群；化肥＋稻草回田處理和化肥＋稻草回田＋餅肥處理的煙田土壤分別是Rhizobiales（根瘤菌目）和Caulobacterales（柄桿菌目）及其目下的細菌種群。