PBMCs宮腔灌注對PCOS患者凍融胚胎移植周期妊娠結(jié)局的影響*

劉 聰，李偉偉，殷秀榮

(河北省秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科 066000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)對育齡期女性的生育功能有重要影響[1-2]。因不排卵和卵母細(xì)胞質(zhì)量差，PCOS患者大多需要促排卵治療，部分患者需要通過輔助生殖技術(shù)獲得妊娠，但PCOS患者因存在高雄激素血癥、胰島素抵抗等內(nèi)分泌代謝異常，會(huì)通過多種途徑導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，流產(chǎn)率升高[3]。

宮腔灌注外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)可使宮腔內(nèi)發(fā)生有利于胚胎侵入的炎性反應(yīng)，其分泌的細(xì)胞因子在胚胎著床、維持妊娠中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。近年來的研究提示，與人絨毛膜促性腺激素(HCG)共培養(yǎng)的PBMCs可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤[5-6]。本文旨在探討PCOS患者凍融胚胎移植(FET)周期應(yīng)用HCG共培養(yǎng)PBMCs宮腔灌注對子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及對臨床妊娠率、流產(chǎn)率的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2017年1月至2019年12月在本院生殖醫(yī)學(xué)科行FET的PCOS為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合PCOS的鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)年齡20～35歲；(3)宮腔鏡檢查未見異常；(4)行IVF/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕，有冷凍胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并甲狀腺功能異常、腎上腺功能異常、高泌乳素血癥、糖尿病等其他內(nèi)分泌疾??；(2)合并消化系統(tǒng)、呼吸體統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等全身性疾??；(3)合并子宮畸形、子宮內(nèi)膜息肉、子宮黏膜下肌瘤、宮腔粘連等子宮器質(zhì)性病變；(4)有染色體異常、活動(dòng)期傳染病。本研究共納入PCOS患者382人，年齡20～35歲。本研究符合臨床操作規(guī)范，通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書后入組。

1.2 內(nèi)膜準(zhǔn)備方法

研究對象采用隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組(192例)和對照組(190例)。所有入選患者選擇誘導(dǎo)排卵方案準(zhǔn)備內(nèi)膜，于月經(jīng)第2～5天給予來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H19991001)2.5 mg，口服，共服藥5 d。從月經(jīng)第10天開始監(jiān)測卵泡發(fā)育情況直至排卵，期間依據(jù)卵泡監(jiān)測情況適時(shí)添加人絕經(jīng)期尿促性腺激素(HMG，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)促進(jìn)卵泡發(fā)育。卵泡直徑≥18 mm或雌激素達(dá)734 pmol/L、內(nèi)膜厚度≥7 mm時(shí)，依據(jù)血黃體生成素(LH) 情況肌肉注射HCG(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)10 000 U誘導(dǎo)排卵。LH<20 mU/mL，于21:00肌肉注射HCG，以隔日為第0天；LH≥20 mU/mL，于14:00～16:00肌肉注射HCG，以次日為第0天，于第3天行胚胎移植。

1.3 自體PBMCs分離及HCG共培養(yǎng)

應(yīng)用經(jīng)陰道超聲動(dòng)態(tài)監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，于排卵前3～5 d，抽取試驗(yàn)組研究對象外周血30 mL，應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞分離液，通過聚蔗糖-泛影葡胺梯度法分離PBMCs，置于RPIM1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司)及10%血清清蛋白中與HCG(3～6 U/mL，麗珠制藥公司)混合共培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后離心、分離PBMCs，將細(xì)胞濃度調(diào)整為(1～5)×106個(gè)/mL，重懸至500～800 μL于5 mL無菌離心管中備用。

1.4 宮腔液收集及PBMCs宮腔灌注

移植前3 d，對試驗(yàn)組和對照組的所有研究對象進(jìn)行宮腔液收集及宮腔灌注。所有患者取膀胱截石位，以0.1%聚維酮碘消毒外陰，0.9%NaCl消毒陰道，移植管(美國Cook公司)置入子宮腔內(nèi)，宮腔灌注前先用胚胎移植管內(nèi)芯輕柔抽吸少量宮腔分泌物，約10 μL置于裝有1 mL磷酸鹽緩沖溶液的無菌試管，反復(fù)沖洗后置于凍存管中(美國Corning公司)，迅速放入液氮中儲(chǔ)存?zhèn)錂z。試驗(yàn)組連接1 mL注射器，抽取已制備好的PBMCs，緩慢注入子宮腔內(nèi)，停留數(shù)秒后取出移植管，灌注劑量為0.5 mL，囑患者臥床休息30 min；對照組使用培養(yǎng)液0.5 mL宮腔灌注，灌注方法同試驗(yàn)組。移植日以同樣方法收集宮腔液待檢。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1宮腔液檢測

宮腔灌注前和胚胎移植前收集的宮腔液樣本10 000 r/min離心10 min，取上清液，使用Bio-Plex懸液芯片系統(tǒng)進(jìn)行檢測。檢測項(xiàng)目包括嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)分泌因子(RANTES)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-1α、IL-2、IL-10等27種免疫相關(guān)的細(xì)胞因子。

1.5.2臨床結(jié)局隨訪

胚胎移植后14 d檢測血HCG，血HCG>6.2 mU/mL診斷為妊娠，繼續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測血HCG變化，血HCG增高明顯者，移植28～30 d行陰道超聲，見孕囊或胎心搏動(dòng)，診斷為臨床妊娠，記錄胚胎著床情況，并計(jì)算著床率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率等臨床指標(biāo)。著床率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，早期流產(chǎn)率=12周前流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

兩組患者的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)性激素、AMH差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 試驗(yàn)組與對照組的一般資料比較

組別nbE2(pmol/L)bFSH(mU/mL)bLH(mU/mL)AMH(ng/mL)試驗(yàn)組192138.92±25.986.87±2.768.97±4.925.16±2.34對照組190142.18±22.786.38±2.189.26±5.285.23±3.11t1.3041.9240.5550.249P0.1930.0550.5790.804

2.2 胚胎移植條件及妊娠結(jié)局比較

試驗(yàn)組與對照組比較，移植優(yōu)胚率、異位妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而試驗(yàn)組的著床率、臨床妊娠率顯著高于對照組，早期流產(chǎn)率顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 試驗(yàn)組與對照組妊娠結(jié)局比較[%(n/n)]

2.3 PBMCs宮腔灌注前后宮腔液細(xì)胞因子表達(dá)變化

比較PBMCs宮腔灌注前后Bio-Plex懸液芯片包括的27種可能與胚胎著床相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果顯示，宮腔灌注后宮腔液中MCP-1、 TNF-α、IL-2的水平較治療前下降，而RANTES、IL-10水平較治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對照組，宮腔灌注前后MCP-1、TNF-α、RANTES、IL-2、IL-10水平無顯著變化，見表3。

表3 試驗(yàn)組與對照組宮腔灌注前后相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化

3 討 論

影響妊娠過程的兩個(gè)重要因素為子宮內(nèi)膜容受性和胚胎質(zhì)量，其中子宮內(nèi)膜因素占60%，胚胎因素占40%[8]。子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵在于細(xì)胞分子水平動(dòng)態(tài)而精準(zhǔn)的調(diào)控，以促使胚胎植入和妊娠的發(fā)生。

PBMCs是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。子宮內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及參與適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，為胚胎著床提供獨(dú)特的內(nèi)分泌-免疫微環(huán)境，對胚胎定植起到積極作用。2006年，YOSHIOKA等[9]報(bào)道了對反復(fù)種植失敗(RIF)患者進(jìn)行PBMCs宮腔灌注，結(jié)果顯示臨床妊娠率和活產(chǎn)率均高于對照組。陳雷寧等[10]對3例RIF患者宮腔灌注PBMCs聯(lián)合凍融FET，均獲得了足月妊娠，隨訪產(chǎn)婦和新生兒情況未發(fā)現(xiàn)異常。研究發(fā)現(xiàn)，HCG與PBMCs共培養(yǎng)后PBMCs分泌的細(xì)胞因子水平增加、滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，表明HCG可以加強(qiáng)PBMCs的相關(guān)作用[5]?；谝陨涎芯浚茰yPBMCs可能在胚胎著床及妊娠的維持中有積極促進(jìn)作用且尚未發(fā)現(xiàn)對孕產(chǎn)婦及新生兒的不良影響。

PCOS是臨床常見的婦科內(nèi)分泌疾病，此類患者由于子宮內(nèi)膜蛻膜化異常[11]、子宮內(nèi)膜容受性下降影響胚胎著床，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局概率明顯升高。因此，積極探索提高PCOS患者的子宮內(nèi)膜容受性的方法有助于提高PCOS患者的胚胎著床率和臨床妊娠率、降低流產(chǎn)率。PBMCs作為重要的免疫細(xì)胞，宮腔灌注后可能通過改變相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)改變宮腔局部微環(huán)境，調(diào)控胚胎植入和免疫耐受過程。本研究采用了HCG共培養(yǎng)的PBMCs對FET周期的PCOS患者進(jìn)行宮腔灌注治療，以期初步探索此方法對改善PCOS患者的妊娠結(jié)局的作用。選擇擬行FET的PCOS患者為研究對象的原因在有兩點(diǎn)：需借助IVF/ICSL進(jìn)行助孕的PCOS患者往往為難治性PCOS患者，更迫切需要一種積極有效的改善妊娠結(jié)局的方法獲得妊娠，更能代表需要多種方法聯(lián)合治療獲得妊娠的PCOS群體；新鮮周期由于控制性超促排卵的應(yīng)用，母體內(nèi)的高雌激素水平會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜種植窗提前出現(xiàn)和關(guān)閉，而且影響內(nèi)膜容受性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，干擾研究結(jié)果的分析。

子宮內(nèi)膜相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)可通過宮腔鏡下內(nèi)膜活檢及宮腔液檢測兩種方式進(jìn)行分析。但宮腔鏡操作屬于有創(chuàng)性操作，患者耐受性、依從性相對較差，且易引起宮腔內(nèi)出血，影響當(dāng)周期移植，延長患者治療時(shí)間，不易被患者接受。而宮腔液抽吸由專業(yè)的生殖醫(yī)生進(jìn)行操作，相對簡單、易行，且方便追蹤隨訪。宮腔液是子宮內(nèi)一種富含蛋白質(zhì)的組織營養(yǎng)液，宮腔液中包含子宮內(nèi)膜的分泌物、血清滲出物、輸卵管液、腹膜液、激活白細(xì)胞的釋放液、細(xì)胞表面蛋白裂解的可溶性產(chǎn)物，為胚胎發(fā)育和植入提供微環(huán)境。宮腔液成分在胚胎植入期的免疫抑制和胚胎發(fā)育中起重要作用，宮腔液分析可以提供子宮內(nèi)膜植入前狀態(tài)的信息，且研究表明，宮腔液的抽吸不影響同一周期妊娠率?；谝陨显?，本研究在行FET的PCOS患者進(jìn)行PBMCs宮腔灌注前后檢測宮腔液的細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PBMCs宮腔灌注后，試驗(yàn)組的MCP-1、TNF-α、IL-2水平下降，RANTES、IL-10水平上升，而對照組沒有發(fā)生相應(yīng)的變化。

CD4+T細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞的一類，分為Th1、Th2細(xì)胞亞型。Th1細(xì)胞介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與免疫排斥，可分泌TNF-γ、TNF-α、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子；Th2細(xì)胞通過體液免疫，減弱Th1細(xì)胞反應(yīng)，促使免疫耐受形成，可分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡對調(diào)整母胎界面的免疫耐受有重要意義。TNF-α在細(xì)胞凋亡和炎癥中起重要作用，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、早產(chǎn)和子癇前期患者血清、胎盤和子宮內(nèi)膜中TNF-α及其受體水平升高[12]。MCP-1可募集、趨化、激活巨噬細(xì)胞，使TNF-α水平升高，誘發(fā)炎性反應(yīng)，使母體對胎兒抗原產(chǎn)生排斥，是反復(fù)流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗的危險(xiǎn)因素[13]。RANTES具有類似封閉抗體的作用，可產(chǎn)生抗父系淋巴細(xì)胞的保護(hù)性抗體，避免胎兒被母體免疫系統(tǒng)排斥[14]。

對研究對象臨床結(jié)局的隨訪顯示，試驗(yàn)組較對照組的胚胎著床率、臨床妊娠率均升高，早期流產(chǎn)率降低。且治療過程中，所有患者均未出現(xiàn)感染、出血等影響移植的情況，提示嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行PBMCs宮內(nèi)灌注及宮腔液抽吸不會(huì)對母體造成不良影響，在FET周期中具有可行性，但其對胎兒的遠(yuǎn)期影響，比如早產(chǎn)率、出生缺陷率是否會(huì)受到影響需進(jìn)一步追蹤隨訪。

綜上所述，宮內(nèi)灌注PBMCs可能通過調(diào)節(jié)MCP-1、TNF-α、RANTES、IL-2、IL-10水平來改善PCOS患者的子宮內(nèi)膜容受性，是難治性PCOS患者改善妊娠結(jié)局的治療方法之一，可為此類患者的治療提供參考。