不同降溫模式下高加索三葉草的轉(zhuǎn)錄組比較分析

牟 丹， 馬戈亮， 卡著才讓， 李宗仁， 忠克吉， 謝久祥*， 李希來*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 西寧 青海 810016； 2. 河南蒙古族自治縣自然資源局， 黃南 青海 811599)

高加索三葉草(TrifoliumambiguumBieb.)是豆科三葉草屬中唯一具有地下根蘗和利用根蘗進(jìn)行強(qiáng)克隆生長的多年生長壽命草種[1]。該物種原產(chǎn)于高緯度的東歐和西亞的高海拔(2 750 m)地區(qū)[2]，當(dāng)?shù)乇容^惡劣的生態(tài)條件使其具有很強(qiáng)的抗寒、抗旱、耐水淹、耐牧等特性[3]。據(jù)報道，在高加索山脈海拔3 200 m的草甸中也能發(fā)現(xiàn)這種植物[3]。

青藏高原具有顯著的高原大陸性氣候，晝夜溫差大，年均溫低，無霜期短，極端低溫、倒春寒等災(zāi)害天氣時有發(fā)生[4-5]。低溫對分布在高海拔或較高緯度的多年生植物來說是一種不可避免的環(huán)境脅迫[6]，嚴(yán)重影響并制約著高寒地區(qū)牧草的生長發(fā)育和優(yōu)良豆科牧草的引種工作[7]。

2015年，本課題組將高加索三葉草從新西蘭引種到青海省河南蒙古自治縣(河南縣)海拔3 500～3 700 m的3處試驗地，發(fā)現(xiàn)其在野外均能自然越冬，并形成了克隆植株[8-9]。河南縣地處青藏高原東部，高原大陸性氣候較明顯。高加索三葉草在河南縣的成功越冬說明其抗寒性很強(qiáng)，足以應(yīng)對河南縣極端低溫等惡劣天氣。目前，對植物響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組研究多集中在單一降溫模式處理，如適溫培養(yǎng)后經(jīng)冷馴化緩慢降溫處理或直接低溫處理[10-12]，而對同一物種在遭遇不同降溫模式的低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組比較研究鮮見報道。本研究以高加索三葉草為材料，利用低溫人工氣候箱模擬緩慢降溫和驟然降溫2種降溫模式對高加索三葉草植株進(jìn)行-6℃低溫脅迫4 h，比較不同降溫模式下的基因表達(dá)差異性和關(guān)鍵通路富集情況，并進(jìn)行抗寒相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子篩選，為高加索三葉草抗寒分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為長勢一致、生長健康的高加索三葉草植株，種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)王明玖教授提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年5—8月在青海大學(xué)校內(nèi)牧草試驗地和草業(yè)科學(xué)系實驗室進(jìn)行。將種子播種到含混合基質(zhì)(草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1)的花盆中。60 d后將長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移到低溫人工氣候箱(光照12 h、晝夜溫度20℃/18℃、光照強(qiáng)度12 000 lx、濕度60%)適應(yīng)性培養(yǎng)30 d。試驗分3組：常溫對照組(CK)、緩慢降溫組(GC)和驟然降溫組(SC)，每組均為3個重復(fù)。常溫對照組的幼苗始終置于適應(yīng)性培養(yǎng)下的培養(yǎng)箱中生長，2個降溫組除溫度外，其余條件均與適應(yīng)性培養(yǎng)下的條件相同，具體過程為：(1)GC組：由20℃以2℃/h降溫速率降到4℃/4℃(晝/夜)處理48 h，然后以2℃/h降溫速率降到2℃/2℃(晝/夜)處理44 h，最后再直接降溫到-6℃進(jìn)行低溫脅迫4 h，期間有光照；(2)SC組：由20℃直接降溫到-6℃進(jìn)行低溫脅迫4 h，期間有光照。從10∶00開始，GC和SC 2個處理組均于-6℃低溫脅迫4 h，在14∶00對2個處理組和CK組同時采樣，剪取葉片并立即置于液氮速凍，后放入-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

使用Trizol試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)從高加索三葉草葉片中提取總RNA。RNA質(zhì)量在Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)上進(jìn)行評估，并使用無RNase的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。使用NEB#7530試劑盒(#E7530,New England Biolabs)進(jìn)行RNA高通量測序文庫構(gòu)建，由廣州基迪奧生物科技有限公司使用Illumina HiSeqTM4000測序平臺進(jìn)行測序。對高通量測序下機(jī)的Raw reads通過fastp[13]進(jìn)行質(zhì)控(去除含adapter的reads、含N比例大于10%的reads和低質(zhì)量的reads)，得到高質(zhì)量Clean reads。利用Trinity[14]軟件對高質(zhì)量的Clean reads進(jìn)行序列組裝，然后通過N50 數(shù)值和基因的數(shù)量進(jìn)行組裝完整性評估。組裝出來的Unigene序列通過blastx比對到非冗余蛋白庫(Non-Redundant Protein Sequence Database,NR)，京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)，同源蛋白簇(Clusters of Orthologous Groups of proteins/euKaryotic Ortholog Groups,COG/KOG)和SwissProt 4大數(shù)據(jù)庫。

1.4 差異表達(dá)基因分析

采用DESeq2[15]軟件對基因差異表達(dá)進(jìn)行分析，基于差異分析結(jié)果，篩選錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate,FDR)<0.05，且歸一化差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1的基因作為差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)。然后通過基因本體論(Gene ontology,GO)[16]和KEGG[17]2大數(shù)據(jù)庫對DEGs進(jìn)行富集分析，符合FDR<0.05的GO條目和KEGG通路被定義為顯著富集的條目和通路。

1.5 實時熒光定量PCR分析

為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)，以高加索三葉草Actin(unigen 0052143)基因為內(nèi)參基因，從對照組和驟然降溫組中隨機(jī)挑選的10個DEGs進(jìn)行實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析，引物設(shè)計見表1，各處理3次重復(fù)，采用相對定量法(2-ΔΔCt)[18]，計算基因的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)評價與功能注釋

從轉(zhuǎn)錄組測序看來，各組的Raw reads均在4 292萬條以上，Clean reads在4 233萬條以上，過濾后總共得到67.31 G的Clean bases，GC含量在43.14%～44.64%，Q20超過 96.87%，Q30超過 91.67%(表2)。通過組裝，得到59 257個Unigene，平均長度為961 bp，N50長1 678 bp(表3)。這些結(jié)果表明，測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量可用于后續(xù)分析。

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計分析

由表4所示，對組裝得到的59 257個Unigene進(jìn)行基本功能注釋，共有37 248個(62.86%)Unigene在NR，KEGG，KOG，SwissProt 4大數(shù)據(jù)庫中注釋成功，分別為37 168個(62.72%)，32 706個(55.19%)，17 636個(29.76%)，21 790個(36.77%)。其中，與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后(圖1)，發(fā)現(xiàn)高加索三葉草與紅三葉(Trifoliumpratense)相似度最高，同源基因相似率達(dá)(24.90%)；其次為蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)(相似率15.67%)和鷹嘴豆(Cicerarietinum)(相似率5.04%)。

表4 Unigene功能注釋情況

圖1 同源物種分布圖

2.2 差異表達(dá)基因(DEGs)篩選與比較

為了鑒定高加索三葉草在不同降溫模式下的DEGs，我們通過FDR<0.05且|log2FoldChange|>1的閾值進(jìn)行篩選。如圖2所示，與CK相比，在GC組和SC組中分別選出8 020個DEGs(4 831個上調(diào)表達(dá)，3 189個下調(diào)表達(dá))和6 289個DEGs(3 390個上調(diào)表達(dá)，2 899個下調(diào)表達(dá))。另外，對2處理組的DEGs進(jìn)行韋恩分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)GC組特有5 314個DEGs，SC組特有3 583個DEGs；2處理組共有 2 706個DEGs，推測這些共有的DEGs是高加索三葉草響應(yīng)低溫脅迫的潛在抗寒基因。

圖2 不同降溫模式下DEGs的火山圖

圖3 不同降溫模式下DEGs的韋恩圖

2.3 DEGs的GO功能富集分析

為了研究高加索三葉草在不同降溫模式下的DEGs涉及的生物學(xué)功能，我們對GC和SC 2處理組的DEGs分別進(jìn)行了GO富集分析。由圖4和表5可知，GC和SC組的DEGs均被富集到生物過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)、和細(xì)胞組分(Cellular component)3個功能類別。生物過程中，2處理組的DGEs均集中在代謝過程(Metabolic process)、細(xì)胞過程(Cellular process)和單有機(jī)體過程(Single-organism process)；在GC組中，顯著性排名前3的GO條目是刺激反應(yīng)(Response to stimulus)、化學(xué)反應(yīng)(Response to chemical)、內(nèi)源性刺激響應(yīng)(Response to endogenous stimulus)；在SC組中，排名前3的是酸性化學(xué)響應(yīng)(Response to acid chemical)、外界刺激的響應(yīng)(Response to external stimulus)、內(nèi)源性刺激響應(yīng)(Response to endogenous stimulus)。分子功能中，2處理組的DGEs均集中在催化活性(Catalytic activity)和結(jié)合(Binding)；在GC組中，排名前3的是氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合(Regulatory region DNA binding)和調(diào)節(jié)區(qū)核酸結(jié)合(Regulatory region nucleic acid binding)；在SC組中，排名前3的是氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移己糖基(Transferase activity,transferring hexosyl groups)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性(Glucosyltransferase activity)。細(xì)胞組分中，2處理組的DGEs均集中在細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞部分(Cell part)和細(xì)胞器(Organelle)；在GC組中，排名前3的是葉綠體(Chloroplast)、光合膜(Photosynthetic membrane)和光合系統(tǒng)(Photosystem)；在SC組中，排名前3的是細(xì)胞壁(Cell wall)、外部封裝結(jié)構(gòu)(External encapsulating structure)和細(xì)胞外周(Cell periphery)。

圖4 不同降溫模式下DEGs的GO富集分析

表5 不同降溫模式下DEGs排名前3的GO條目

2.4 DEGs的KEGG富集分析

為了探究高加索三葉草響應(yīng)不同降溫模式的代謝通路情況，我們對GC和SC 2處理組的DEGs分別進(jìn)行了KEGG通路富集分析。如圖5所示，GC組的DEGs在光合作用(Photosynthesis)、光合作用天線蛋白(Photosynthesis-antenna proteins)和淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)等通路中顯著富集；SC組的DEGs在淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、玉米素生物合成(Zeatin biosynthesis)、倍半萜和三萜生物合成(Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)、二萜生物合成(Diterpenoid biosynthesis)、類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)和苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)等通路中顯著富集。

圖5 不同降溫模式下DEGs的KEGG富集分析

2.5 抗寒相關(guān)基因分析

由韋恩分析結(jié)果推測，共有的2 706個DEGs可能是不同降溫模式下高加索三葉草潛在的抗寒基因，因此對其進(jìn)行GO與KEGG富集分析(圖6)。GO富集分析表明這些DEGs在生物過程、分子功能和細(xì)胞成分3類別中共有91條顯著富集的GO條目，包括激素應(yīng)答(Response to hormone)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、二糖響應(yīng)(Response to disaccharide)、非生物刺激響應(yīng)(Response to abiotic stimulus)和二糖代謝過程(Disaccharide metabolic process)等。KEGG富集分析表明這些DEGs僅在淀粉和蔗糖代謝通路中顯著富集；此外，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中所富集的DEGs數(shù)目最多。結(jié)合GO與KEGG富集分析結(jié)果推測淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)2條通路可能是參與高加索三葉草低溫脅迫響應(yīng)的重要代謝途徑。為進(jìn)一步研究其響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制，本研究對這2條通路中特異上調(diào)的DEGs進(jìn)行了重點分析。經(jīng)過篩選，得到16個潛在的抗寒相關(guān)基因(表6)。

圖6 抗寒相關(guān)基因的GO和KEGG富集分析

表6 高加索三葉草抗寒關(guān)鍵基因

2.6 抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析

對由韋恩分析得到的共有DEGs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析，篩選到了屬于29個轉(zhuǎn)錄因子家族的150個轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)(圖7)。其中，含轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的家族為AP2/ERF，其次為ZFP，MYB，WRKY，NAC等。進(jìn)一步對GC和SC 2處理組中的這150個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量進(jìn)行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在GC組中有105個上調(diào)，45個下調(diào)；在SC組中有102個上調(diào)，48個下調(diào)；而在2處理組中均上調(diào)的有93個，均下調(diào)的有36個。另外，通過GO富集分析篩選出7個響應(yīng)低溫(Response to cold)且上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中，AP2/ERF家族的DREB1/CBF亞家族有6個(3個DREB1A、2個DREB1C、1個DREB1F)，ZFP家族中1個(1個ZAT11)。

圖7 抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析

2.7 實時熒光定量PCR驗證

利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測隨機(jī)挑選的 10 個DEGs的表達(dá)模式結(jié)果可知(圖8)，這些基因的表達(dá)趨勢與RNA-Seq結(jié)果一致，說明RNA-Seq數(shù)據(jù)真實可靠。

3 討論

溫度是影響所有生物的重要環(huán)境因素，在低溫脅迫下可以正常生長的植物種類較少，低溫脅迫嚴(yán)重改變了植物的生長、發(fā)育、生產(chǎn)力和分布[19]。高加索三葉草是一種優(yōu)良豆科牧草，具有強(qiáng)大的抗寒能力[20]，可在接近海平面以及高海拔地區(qū)正常生長[21]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序比較了高加索三葉草在不同降溫模式下的差異表達(dá)基因數(shù)量和關(guān)鍵通路，還分析了潛在的抗寒基因和轉(zhuǎn)錄因子,這些結(jié)果將有助于了解高加索三葉草響應(yīng)低溫脅迫的分子調(diào)控機(jī)制。

3.1 高加索三葉草響應(yīng)不同降溫模式的轉(zhuǎn)錄差異

本研究由高加索三葉草的RNA-seq數(shù)據(jù)組裝得到59 257個Unigene，其中62.86%的Unigene在4大數(shù)據(jù)庫中注釋成功。同時，與NR數(shù)據(jù)庫比對后，發(fā)現(xiàn)高加索三葉草與紅三葉的同源相似率最高(24.90%)。與CK相比，在GC和SC 2處理組中均篩選到大量的DEGs，而GC組的DEGs數(shù)量高于SC組，且前者特異表達(dá)的DEGs也高于后者。這一結(jié)果說明不同降溫模式的低溫脅迫均可誘導(dǎo)高加索三葉草表達(dá)大量的基因來緩解低溫傷害，而緩慢降溫過程可誘導(dǎo)表達(dá)更多的基因和特異基因來抵御低溫。菊花(Dendranthemagrandiflorum)經(jīng)冷馴化后再降溫處理的差異表達(dá)和特異表達(dá)基因數(shù)量均高于直接降溫處理的數(shù)量[22]，這與本研究結(jié)果一致。

富集分析表明高加索三葉草面臨不同降溫模式的低溫脅迫時，在代謝通路方面會作出不同的響應(yīng)。相關(guān)研究表明短時間的低溫會破壞光能的吸收與轉(zhuǎn)運[23]，本研究中GC組的DEGs在光合作用通路中顯著富集，推測低溫脅迫嚴(yán)重影響高加索三葉草在緩慢降溫過程中的光合作用。另一方面，SC組的DEGs在倍半萜和三萜生物合成、二萜生物合成通路中顯著富集。植物對短期和長期的環(huán)境溫度變化均能迅速調(diào)節(jié)萜類化合物合成途徑[24]，由此推測高加索三葉草能通過快速調(diào)節(jié)萜類化合物生物合成通路來應(yīng)對驟然降溫。此外，SC組的DEGs在類黃酮生物合成和苯丙烷生物合成通路中顯著富集，這和冷凍脅迫下油菜(BrassicanapusL.)的DEGs富集結(jié)果相似[12]。苯丙烷生物合成途徑在植物面臨低溫脅迫時發(fā)揮重要作用[25]，在該途徑和類黃酮生物合成途徑中，某些次生代謝物質(zhì)的積累可以增強(qiáng)植物清除低溫脅迫產(chǎn)生的活性氧的能力，是一種積極地自我保護(hù)機(jī)制[26]，據(jù)此推測苯丙烷、類黃酮等次生代謝產(chǎn)物合成途徑在高加索三葉草響應(yīng)驟然降溫過程中起著關(guān)鍵作用。值得注意的是，2處理組的DEGs均在淀粉和蔗糖代謝中顯著富集，結(jié)果與Wang等[22]對菊花響應(yīng)冷馴化或非冷馴化后的冷凍脅迫轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果類似，可看出淀粉和蔗糖代謝在高加索三葉草響應(yīng)不同降溫模式的低溫脅迫時均具有重要作用。

3.2 高加索三葉草關(guān)鍵抗寒基因

糖在植物中不僅用于能量代謝，也對植物生長發(fā)育、代謝調(diào)控及抵抗脅迫等方面具有重要調(diào)節(jié)作用[27]。植物面臨低溫脅迫時，糖可以提供碳源和底物來誘導(dǎo)其他相關(guān)的抗寒性和生理生化過程，有助于增強(qiáng)抗寒性，還可以避免低溫引起的蛋白質(zhì)凝固，進(jìn)一步提高植物的抗寒性[28-29]。本研究通過對GC和SC 2處理組共有DEGs進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些DEGs僅在淀粉和蔗糖代謝通路中顯著富集。在此通路中，篩選出一個編碼β-淀粉酶(Beta-amylase,BAM)的基因BAM3，其表達(dá)量在低溫脅迫后顯著上調(diào)。BAM是一種重要的淀粉水解酶，分解淀粉生成麥芽糖[30]。溫度脅迫下，煙草(Nicotianatabacum)過度表達(dá)PtrBAM1能提高BAM活性、促進(jìn)淀粉降解、增加麥芽糖和可溶性糖的含量[31]。本研究還篩選出一個上調(diào)的編碼β-呋喃果糖苷酶(Beta-fructofuranosidase,β-FFase)或稱轉(zhuǎn)化酶(Invertase,Inv)的基因BFRUCT1。Inv能將蔗糖水解為葡萄糖和果糖[32]，也能通過調(diào)節(jié)滲透壓改變植物細(xì)胞的生理狀態(tài)[33-34]。此外，蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SuSy)能將蔗糖分解為果糖和尿苷二磷酸葡萄糖[35]；Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下，SUS基因在煙草中上調(diào)表達(dá)，這與我們的研究結(jié)果一致。由此推測，高加索三葉草通過上調(diào)表達(dá)這些基因來促進(jìn)可溶性糖的合成，從而提高自身抗寒性。

植物激素不僅能夠調(diào)控植物正常的生長發(fā)育過程，在植物抵御低溫等外界環(huán)境脅迫中也發(fā)揮著重要作用[37]。本研究中，2處理組的DEGs在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集數(shù)量最多，這表明激素信號通路在高加索三葉草對低溫的響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。這些DEGs主要富集在生長素和脫落酸2種信號途徑中。其中，涉及生長素信號通路的4個生長素早期響應(yīng)基因(IAA12，IAA26，GH3.1，SAUR32)的表達(dá)量均上調(diào)，在水稻(Oryzasativa)響應(yīng)低溫脅迫的研究中也出現(xiàn)類似結(jié)果[38]。據(jù)報道，擬南芥(Arabidopsis)的一個GH3的功能獲得型突變體wes1-D表現(xiàn)明顯的抗凍表型[39]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)2個上調(diào)的涉及脫落酸信號通路的SAPK2基因，均編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase,SAPK/SnRK)。SnRK2蛋白激酶家族成員的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)AREB/ABFs轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而促進(jìn)低溫脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抵御環(huán)境脅迫[40-41]?？梢钥闯觯呒铀魅~草可能通過上調(diào)表達(dá)這些與激素相關(guān)的基因來促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抵御低溫脅迫。

3.3 高加索三葉草主要抗寒轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[42]。目前已經(jīng)鑒定了一系列參與調(diào)控植物低溫脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，包括AP2/ERF，MYB，bHLH，ZFP，NAC，WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族成員[43]。本研究中，從GC和SC 2處理組共有的DEGs中篩選到150個轉(zhuǎn)錄因子。在這些轉(zhuǎn)錄因子中，AP2/ERF家族成員最多(28個)，推測它們在高加索三葉草對低溫脅迫的反應(yīng)中起重要作用。AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子，尤其是DREB1/CBF亞家族轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是植物冷馴化的重要調(diào)節(jié)因子，它們能大量調(diào)控冷誘導(dǎo)基因如COR的表達(dá)，從而提高植物抗寒性[44-45]。研究表明，擬南芥DREB1/CBF基因的表達(dá)受到低溫脅迫誘導(dǎo)[46]。本研究篩選到與低溫響應(yīng)有關(guān)的6個上調(diào)表達(dá)且屬于DREB1/CBF亞家族的轉(zhuǎn)錄因子。同時，還篩選到17個MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在逆境脅迫的調(diào)控方面具有重要作用[47-48]。Yang等[49]報道，超量表達(dá)OsMYB2基因能顯著增強(qiáng)水稻植株對低溫脅迫的抗性。本研究也發(fā)現(xiàn)了1個編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因MYB2，其表達(dá)量在2個比較組中均上調(diào)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。此外，其他參與植物非生物脅迫過程的常見轉(zhuǎn)錄因子家族，如WRKY，NAC，bHLH等，也在我們的研究中被發(fā)現(xiàn)，這與在其他植物中的報道一致[11-12]。由此說明這些轉(zhuǎn)錄因子在高加索三葉草響應(yīng)低溫脅迫過程中可能具有重要的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

高加索三葉草在面臨不同降溫模式的低溫脅迫時具有不同的響應(yīng)機(jī)制，應(yīng)對緩慢降溫的DEGs顯著富集在光合作用、光合作用天線蛋白、淀粉和蔗糖代謝等通路。應(yīng)對驟然降溫的DEGs顯著富集在淀粉和蔗糖代謝、倍半萜和三萜生物合成、類黃酮生物合成等通路。一些涉及淀粉和蔗糖代謝與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因在兩種降溫模式下均上調(diào)表達(dá)，可作為潛在的抗寒基因。另外，響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子多分布在AP2/ERF，ZFP，MYB等家族。