海洋環(huán)境中抗生素抗性基因的水平傳播研究*

蘇 潔 付韻涵，2 明紅霞 關(guān)道明 樊景鳳#

(1.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116023；2.大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

近年來，由于抗生素的廣泛使用加速了抗生素抗性基因(ARGs)在水生環(huán)境中的傳播擴(kuò)散，這些ARGs可能會(huì)通過直接或間接接觸進(jìn)入人體，從而給公共健康帶來巨大威脅。世界衛(wèi)生組織的報(bào)告顯示，抗生素抗性已成為威脅人類健康的全球重大公共衛(wèi)生安全問題之一。據(jù)報(bào)道，全球每年因耐藥細(xì)菌感染而導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過70萬人，估計(jì)到2050年，耐藥細(xì)菌感染將累計(jì)導(dǎo)致全球1 000萬人死亡[1]。

海洋環(huán)境逐步成為ARGs傳播擴(kuò)散的重要媒介之一[2]，[3]7593。海洋環(huán)境中存在著3個(gè)層次的抗生素抗性污染源和傳播載體：耐藥細(xì)菌庫、抗性質(zhì)粒庫和ARGs庫。自然海水的流動(dòng)特性加速了ARGs在海洋環(huán)境中的傳播擴(kuò)散，每一污染源和傳播載體都呈指數(shù)形式擴(kuò)散[4]。然而，目前關(guān)于海洋環(huán)境中ARGs的傳播分布或基因類型的研究較少。因此，本研究結(jié)合國內(nèi)外最新研究進(jìn)展，綜述ARGs水平傳播的分子元件、海洋環(huán)境中水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)的分子機(jī)制和海洋環(huán)境中ARGs的種類、傳播分布，以期為海洋環(huán)境中ARGs的傳播擴(kuò)散研究及污染防治提供理論依據(jù)。

1 ARGs水平傳播的分子元件

環(huán)境細(xì)菌的抗生素抗性可以是固有的，也可通過自發(fā)突變或HGT獲得?；蚪M中可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)主要包括質(zhì)粒、插入序列(IS)、轉(zhuǎn)座子、基因組島(GI)、整合子和噬菌體等，其可通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式進(jìn)行基因水平傳播。MGEs能介導(dǎo)環(huán)境中的ARGs形成基因簇并在不同宿主中擴(kuò)散和傳播。原核生物中發(fā)現(xiàn)的MGEs見表1。質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體DNA復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，可編碼多種遺傳決定因子。趙莎[12]研究表明，娛樂海水環(huán)境分離的大腸桿菌菌株攜帶的耐藥性基因可通過質(zhì)粒接合在同種屬菌株中進(jìn)行傳遞。IS是最小且最簡單的自主MGEs，其具有一個(gè)或兩個(gè)開放閱讀框，并編碼被接頭區(qū)域包圍的轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動(dòng)的DNA序列，可通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置。轉(zhuǎn)座子可攜帶ARGs在同種屬及不同種屬菌株間進(jìn)行傳遞。整合子位于質(zhì)粒和染色體上，具有用于捕獲基因的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，移動(dòng)基因盒中包含ARGs。GI是一類重要的MGEs，除攜帶有轉(zhuǎn)座子、IS等分子元件外，也包含毒力因子、ARGs、代謝調(diào)控相關(guān)等功能基因。ICEs是與細(xì)胞染色體一起整合并與之復(fù)制的自交聯(lián)MGEs。

表1 原核生物中發(fā)現(xiàn)的MGEsTable 1 MGEs found in prokaryotes

噬菌體是感染細(xì)菌以利用宿主細(xì)胞的代謝和復(fù)制機(jī)制組裝自身的病毒。一些噬菌體可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮HGT的作用，從而將DNA在細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。當(dāng)細(xì)菌DNA的片段隨機(jī)包裝在噬菌體顆粒中或特定的細(xì)菌DNA的某些區(qū)域與病毒基因組一起攜帶時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)就成為一種較普遍的轉(zhuǎn)移方式。噬菌體是目前已知的地球上數(shù)量最多的生物體，并且可通過基因轉(zhuǎn)移改變細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能。PARSLEY等[13]發(fā)現(xiàn)，污水處理廠的噬菌體DNA和排污河流的水樣中都存在β-內(nèi)酰胺類和甲氧西林類ARGs，多家醫(yī)院和污水處理廠排水中噬菌體DNA攜帶β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類ARGs。由此可見，噬菌體在ARGs的水平傳播中發(fā)揮著重要的作用。

2 海洋環(huán)境中HGT的分子機(jī)制

一直以來，主要有3種機(jī)制假說被認(rèn)為可導(dǎo)致ARGs在海洋環(huán)境中的傳播擴(kuò)散：(1)通過陸地來源的耐藥性細(xì)菌的沿海徑流。然而，一些ARGs在海洋微生物類群中被檢測到，因此從陸地來源導(dǎo)致的ARGs傳播擴(kuò)散不能完全解釋這一現(xiàn)象。(2)海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)活動(dòng)產(chǎn)生的抗生素的入海徑流，使天然細(xì)菌變得具有抗性。如智利海洋鮭魚養(yǎng)殖場僅在2016年就使用了363.4 t抗生素，這種巨大的抗生素選擇壓力誘導(dǎo)了海洋環(huán)境中抗生素抗性的產(chǎn)生[14]。對波羅的海養(yǎng)殖場魚腸樣品進(jìn)行宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，魚腸中的ARGs與養(yǎng)殖場沉積物中的ARGs相同，這表明魚糞可能導(dǎo)致ARGs在養(yǎng)殖場沉積物中的富集。在進(jìn)入海水養(yǎng)殖場前的幼魚孵化和飼養(yǎng)期間使用抗生素可能是導(dǎo)致魚腸中存在ARGs的原因。但也有人提出水環(huán)境中ARGs轉(zhuǎn)移到魚腸的可能性[15]。由于呋喃妥因和磺胺二甲氧嘧啶是人工合成抗生素，微生物相互作用中不會(huì)產(chǎn)生此類化合物，因此呋喃妥因和磺胺二甲氧嘧啶ARGs的產(chǎn)生可能是抗生素壓力選擇的結(jié)果。從人工海水養(yǎng)殖區(qū)附近海域中也分離到多種耐藥細(xì)菌[16-19]。此外，PORT等[20]研究表明：近岸海域ARGs的檢出率較高，推斷人為輸入可能影響ARGs的遷移模式；開放海洋樣本中ARGs的檢出率低于靠近岸邊樣本，而ARGs在近海(如夏威夷海)和近岸(如洛杉磯港)環(huán)境中檢出率是相似的。(3)對海洋環(huán)境中抗性活性物質(zhì)的自然選擇。微生物間的拮抗作用可能發(fā)生在海雪或海水中的小顆粒上[21]。這些相互作用可能導(dǎo)致海洋中抗性活性物質(zhì)的產(chǎn)生及其抗性的選擇。如通過預(yù)過濾去除顆粒，顆粒相關(guān)的微生物相互作用可能就不會(huì)對抗性選擇產(chǎn)生明顯影響。然而，使用具有擴(kuò)散性能的化合物時(shí)，微生物間相互作用也會(huì)發(fā)生在水體中[22]。如果這種相互作用是常見的，這可能導(dǎo)致海洋環(huán)境中ARGs的廣泛存在。

2015年，HATOSY等[3]7598基于宏基因組學(xué)研究結(jié)果提出了第4種可能機(jī)制：某些蛋白質(zhì)會(huì)通過調(diào)節(jié)微生物自身細(xì)胞代謝過程對抗生素產(chǎn)生抗性。他們的數(shù)據(jù)支持了這一假設(shè)，因?yàn)橛行〢RGs同時(shí)也在細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮主要功能(如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氧化還原酶和水解酶)。來自兩種抗生素敏感菌株的基因轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞時(shí)也會(huì)產(chǎn)生抗性，這一選擇機(jī)制可以解釋對人工合成抗生素(如磺胺二甲氧嘧啶和呋喃妥因)的耐藥性，也能部分解釋ARGs在水生環(huán)境中的高檢出率和高多樣性。增加的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)相互作用，可能會(huì)產(chǎn)生新的基因組并誘導(dǎo)抗性。因此，海洋環(huán)境中的生物體可能是大量潛在ARGs的儲(chǔ)存庫，這些基因可在某些環(huán)境條件刺激(如存在合適的啟動(dòng)子)下產(chǎn)生抗性。

3 海洋環(huán)境中ARGs的種類及傳播分布

海洋環(huán)境中的ARGs主要源于污水處理廠、抗生素生產(chǎn)廠、養(yǎng)殖場。然而，每一排放源對于海洋環(huán)境中ARGs的輸入類型、影響程度及總量占比目前尚不清楚[23]。ARGs已在近岸海域、深海、極地等不同海洋環(huán)境中被檢出。通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法相結(jié)合，目前已在海洋環(huán)境中檢測到四環(huán)素、磺胺、氟喹諾酮、第3代頭孢、廣譜β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌、氯霉素耐藥菌及相關(guān)ARGs。渤海、黃海和東海沉積物中均檢測到較高豐度的磺胺類ARGs——sul1和sul2(見表2)，而南海深海沉積物中大環(huán)內(nèi)酯類及多肽類ARGs豐度較高。宏基因組數(shù)據(jù)顯示，受人類活動(dòng)影響較頻繁的珠江河口的沉積物中ARGs比南海深海更加多樣化，同時(shí)珠江口沉積物中豐度最高的3種ARGs與磺胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類抗生素濃度呈顯著相關(guān)，說明該地區(qū)ARGs的傳播可能主要受人類活動(dòng)影響[28]。SUZUKI等[30]對馬尼拉海灣海水中ARGs研究發(fā)現(xiàn)，sul1和sul2是可培養(yǎng)細(xì)菌中的主要磺胺類ARGs，而sul3是由海水中不可培養(yǎng)細(xì)菌傳播的。ZHAO等[31]調(diào)查了海河河口沉積物中ARGs胞外和胞內(nèi)DNA的分布，結(jié)果表明，沿海地區(qū)樣本中多重耐藥基因高度多樣化且豐富。ZHU等[32]采用高通量定量方法在中國沿海18個(gè)河口沉積物中均檢測到ARGs。

表2 海洋環(huán)境中ARGs和MGEs的種類和分布Table 2 Types and distribution of ARGs and MGEs in marine environment

海水養(yǎng)殖環(huán)境中已發(fā)現(xiàn)磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類等ARGs，并普遍存在于養(yǎng)殖海水、沉積物和海產(chǎn)品體內(nèi)。養(yǎng)殖海水中磺胺類(sul1和sul2)和四環(huán)素類(tetA和tetB)ARGs的檢出豐度較高，但不同采樣點(diǎn)差異較大。CHEN等[37]對中國13個(gè)主要海水養(yǎng)殖場中ARGs的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖海水和沉積物中磺酰胺類ARGs的絕對拷貝數(shù)和相對豐度分別比四環(huán)素類ARGs高4.3、2.3倍，其中主要的ARGs為sul2。為克服現(xiàn)有ARGs引物的局限性，GAO等[38]采用Illumina高通量測序來分析中國沿海10個(gè)養(yǎng)殖場沉積物中ARGs，結(jié)果表明，所有沉積物樣品中bacA的豐度最高，其次是mexF和mexB。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對海水養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖不僅會(huì)增加附近海域的ARGs豐度，還會(huì)增加遠(yuǎn)離水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域的環(huán)境中多重耐藥性細(xì)菌的檢出率[48-49]。

娛樂海洋環(huán)境傳播的微生物疾病已逐步成為公眾關(guān)注的首要問題之一，目前國內(nèi)外學(xué)者也對海水浴場中ARGs進(jìn)行了大量研究。研究表明，英國近岸海水浴場中沖浪者腸道內(nèi)含有耐藥性大腸桿菌的檢出率是普通人的3倍[39]。TURGEON等[40]檢測發(fā)現(xiàn)，2005年在魁北克南部近200個(gè)海水浴場中采集的海水樣品中耐藥性大腸桿菌的檢出率比2004高10%。KOTLARSKA等[41]調(diào)查表明，葡萄牙Berlenga浴場海水中大腸桿菌多重耐藥率高達(dá)39%，并檢測到質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(blaTEM)及喹諾酮類ARGs(qnrS1)。ANDRADE等[42]發(fā)現(xiàn)，耐藥性大腸桿菌在浴場濕砂、干砂中的檢出率(53.7%、53.8%)比浴場海水中(50%)高。研究發(fā)現(xiàn)，大連星海浴場海水中大腸桿菌多重耐藥狀況嚴(yán)重，耐藥菌株中四環(huán)素類ARGs的陽性檢出率最高[43-44]。相較遠(yuǎn)海而言，近岸海域中多種ARGs和MGEs的高度富集進(jìn)一步證明了人類活動(dòng)對ARGs產(chǎn)生和傳播的重要影響[45]。

原始的極地海洋環(huán)境也發(fā)現(xiàn)了ARGs。北極海洋沉積物中檢測到26種ARGs，定量PCR檢測結(jié)果表明，磺胺類ARGs(sul1、sul2和sul3)豐度最高，β-內(nèi)酰胺類ARGs(blaSHV-1、blaGES-1、blaNDM-1和blaKPC)未檢出[46]。南極海水樣品中分離到攜帶廣譜β-內(nèi)酰胺酶型CTX-M基因的細(xì)菌，多位點(diǎn)序列分型技術(shù)結(jié)果表明，此細(xì)菌已在人體中被分離出，這說明與人類相關(guān)的ARGs已傳播擴(kuò)散到全球[47]。北極新奧爾松地區(qū)鹿糞及鳥糞糞土中分離到的85株大腸桿菌對利福平全部耐藥，南極企鵝糞便中也分離到耐藥性大腸桿菌，這說明抗生素抗性已出現(xiàn)于極地野生動(dòng)物腸道菌群中[50]。

4 結(jié) 語

ARGs不再僅僅是一個(gè)臨床問題，大量天然ARGs庫的發(fā)現(xiàn)更凸顯了自然環(huán)境在ARGs傳播中的作用。海洋覆蓋地球表面積的70%，包含1029數(shù)量級(jí)的細(xì)菌細(xì)胞，也是一個(gè)具有多層次耦合的自然系統(tǒng)。鑒于海洋容易快速輸送水團(tuán)，并且是海洋經(jīng)濟(jì)生物的重要棲息地，海洋環(huán)境可能是ARGs的重要全球儲(chǔ)存庫。海洋中水、汽、冰三態(tài)轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性及海水在包括波浪、潮汐、海流等水文動(dòng)力下的不停運(yùn)動(dòng)，都會(huì)直接或間接影響海洋環(huán)境中的微生物生境，進(jìn)而影響細(xì)菌耐藥性的傳播擴(kuò)散。雖然ARGs在海洋環(huán)境耐藥性傳播中的重要性已被認(rèn)識(shí)到，但目前國內(nèi)外研究僅局限于海洋生物體或微生物耐藥性及其ARGs檢測層面，ARGs在海洋環(huán)境及海洋細(xì)菌間的傳播擴(kuò)散機(jī)制和在海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中的傳遞機(jī)制等問題還有待后期深入研究。

大量研究表明，海水養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素與其相關(guān)ARGs之間存在顯著相關(guān)性，因此通過海水循環(huán)、沉積物懸浮和生物體遷移，大量的抗生素殘留物和ARGs可能最終被傳播到海洋環(huán)境中。未來的研究應(yīng)集中在減少海水養(yǎng)殖中使用抗生素和控制ARGs的傳播擴(kuò)散方面。政府應(yīng)制定更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范抗生素的使用和監(jiān)測，建議考慮將養(yǎng)殖廢水和污泥中的ARGs作為監(jiān)測指標(biāo)，以便有效控制抗生素污染。

近年來，隨著宏基因組測序技術(shù)的發(fā)展，一些非培養(yǎng)的技術(shù)手段在微生物研究中發(fā)揮著日益重要的作用。宏基因組測序技術(shù)能快速高效地獲取整個(gè)微生物群落的基因組信息，對ARGs的探索也能擴(kuò)展到更廣泛的生物體，包括不可培養(yǎng)的物種。這些進(jìn)步將增加微生物群落間ARGs水平傳播途徑的認(rèn)識(shí)?？紤]到ARGs是“容易獲得，難以丟失”的污染物，并且可能在無抗生素壓力環(huán)境中檢測到，因此科學(xué)界和政府也應(yīng)該共同合作，制定相關(guān)政策和研究計(jì)劃減少抗生素的使用，從而減少ARGs在臨床和環(huán)境中的傳播和擴(kuò)散。