EPO對低氧狀態(tài)下牙髓細(xì)胞增殖和保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

殷亮亮，李春年

(河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院, 河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科,河北省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，河北 石家莊 050017)

牙髓壞死主要是由牙髓缺氧造成的。細(xì)菌感染、溫度、充填材料的物理化學(xué)刺激、創(chuàng)傷等都會(huì)造成牙髓組織處于缺氧狀態(tài)。線粒體[1]是體內(nèi)氧氣使用的主要場所，其功能障礙在缺氧性疾病的病理生理發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。組織缺氧時(shí)，三磷酸腺苷生成減少，進(jìn)而降低線粒體的呼吸功能。嚴(yán)重缺氧時(shí)線粒體可出現(xiàn)腫脹、嵴崩解、外膜破裂和基質(zhì)外溢等病變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞本身及周圍組織的溶解、壞死。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)最初被認(rèn)為只在調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-3]。越來越多的研究表明，EPO是DNA缺氧反應(yīng)元件的關(guān)鍵基因之一，缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)可以與EPO結(jié)合并驅(qū)動(dòng)其轉(zhuǎn)錄，提供組織保護(hù)。EPO信號(hào)具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、刺激血管生成等。此外，EPO通過抑制白細(xì)胞介素等多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，具有良好的抗炎作用。由于EPO能夠促進(jìn)血管生成并具有抗炎活性，推測EPO這些特征可能在牙髓修復(fù)和再生中發(fā)揮著作用。然而，到目前為止，EPO對缺氧狀態(tài)下牙髓細(xì)胞的作用還未見報(bào)道。因此，本研究通過觀察缺氧條件下EPO對牙髓細(xì)胞的作用，探討低氧狀態(tài)下牙髓細(xì)胞的增殖和保護(hù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診因正畸需拔出的前磨牙或第三磨牙，男性10例，女性8例，年齡14～18歲，平均年齡16歲，未做過充填治療和牙髓治療，無齲壞，無根裂。

患者已簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(Thermo Eleetron公司)；倒置相差顯微鏡(德國ZEISS公司)；Synergy-TH酶標(biāo)儀(美國Biotech公司)；低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；YP2001N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；高壓蒸汽滅菌器(日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)器材 25 cm2培養(yǎng)瓶，75 cm2培養(yǎng)瓶(ThermoFisher，美國)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清，青、鏈霉素混合液，PBS磷酸鹽緩沖液(以色列BI公司)；高糖DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)液，胰蛋白酶(美國Gibico公司)CCK-8試劑盒，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase activity，ALP)試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所)；EPO(沈陽三生制藥有限責(zé)任公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1離體牙取材 牙齒拔除后自根尖部至冠部碘伏消毒3遍，高速手機(jī)和無菌水冷卻在牙頸部制備環(huán)形溝槽，不能穿髓，制備完成后將離體牙立刻置于預(yù)冷的含有1%雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，1 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室對牙髓組織取材，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3.2牙髓細(xì)胞培養(yǎng) 將收集的離體牙用含有2%雙抗(200 g/mL青霉素和200 g/mL鏈霉素)的PBS溶液清洗3遍，用技工剪沿著牙頸部預(yù)磨好的凹槽剪斷，拔髓針取出牙髓后剪去根尖區(qū)2 mm的牙髓，剩余的牙髓組織用含1%雙抗PBS溶液清洗3遍，將清洗干凈的牙髓組織用無菌眼科剪剪碎，使組織塊體積約為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，移入15 mL離心管中，加入1 mL的I型膠原酶(3 g/L)和中性蛋白酶(4 g/L),置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，消化40 min，每隔15 min吹打組織塊，使組織塊與酶充分接觸，直到組織塊消化為棉絮狀，然后加入3 mL含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化，并進(jìn)行吹打，充分接觸。將離心機(jī)設(shè)置為1 000 r/min，離心5 min，去除上清液，加入3 mL的含10%FBS的培養(yǎng)液重懸，將懸液接種于8 cm2培養(yǎng)皿中，在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長匯合至80%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.3牙髓細(xì)胞的傳代 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞外形及細(xì)胞狀態(tài)，原代牙髓細(xì)胞生長至80%時(shí)，可進(jìn)行傳代。在超凈工作臺(tái)下用1%雙抗PBS蕩洗培養(yǎng)皿3遍,清洗力度要輕柔，防止細(xì)胞損傷。然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，溶液量要達(dá)到與培養(yǎng)皿底細(xì)胞充分接觸，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 min，在顯微鏡下及時(shí)觀察，當(dāng)貼壁細(xì)胞趨于圓形、細(xì)胞開始少量飄起時(shí)，加入2～3倍胰蛋白酶溶液體積的完全培養(yǎng)基終止消化。用巴氏吸管將皿底的細(xì)胞充分吹打，使細(xì)胞從皿底脫壁，移入離心管中，將離心機(jī)設(shè)置為1 000 r/min，離心5 min，去除上清液，加入3 mL含10% FBS的培養(yǎng)液重懸，按1∶2或1∶3進(jìn)行傳代，加入適量培養(yǎng)液，混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，之后每3 d換液，牙髓細(xì)胞生長至80%時(shí)，進(jìn)行下一次傳代。

1.3.4牙髓細(xì)胞的凍存 取正常生長并增殖至80%的牙髓細(xì)胞，PBS清洗3遍，消化離心后獲得細(xì)胞團(tuán)塊，加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞凍存液(配置方法：10% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、30%胎牛血清、60% 高糖培養(yǎng)基，現(xiàn)配，細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為(1～3)×106個(gè)/mL，細(xì)胞懸液分裝成每管1 mL至凍存管，在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、時(shí)間及操作者。凍存步驟為4 ℃、30 min，-20 ℃、60 min，-80 ℃過夜然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長期保存。凍存后1周取一管進(jìn)行復(fù)蘇，檢測細(xì)胞凍存效果，以便進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.5牙髓細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮容器中取出凍存管，在37 ℃恒溫水浴箱中浸泡，并不斷搖動(dòng)使其盡快融化。從37 ℃水浴中取出凍存管，吸出細(xì)胞懸液，移入離心管中并加入10倍以上培養(yǎng)液，混勻，離心5 min，棄上清，加入含10%FBS培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，之后每3 d換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6CCK-8法檢測EPO在低氧狀態(tài)下對牙髓細(xì)胞增殖的影響 ①選用第4代生長狀態(tài)良好的牙髓細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制取細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/mL密度接種至96孔板內(nèi)，每孔200 μL，24 h細(xì)胞貼壁后，吸去孔中培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍。②實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組中在貼壁細(xì)胞孔內(nèi)加入200 μL含有濃度為20 U/mL EPO的完全培養(yǎng)液，對照組中在貼壁細(xì)胞孔內(nèi)加入200 μL僅含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。③將培養(yǎng)箱氧氣濃度調(diào)至1%，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS清洗3遍后每孔加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～4 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長的OD值。

1.3.7ALP檢測EPO在低氧狀態(tài)下對牙髓細(xì)胞分化的影響 ①選用第4代生長狀態(tài)良好的牙髓細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制取細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/mL密度接種至96孔板內(nèi)，每孔200 μL，24 h細(xì)胞貼壁后，吸去孔中培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍。②實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組中在貼壁細(xì)胞孔內(nèi)加入200 μL含有濃度為20 U/mL EPO的完全培養(yǎng)液，對照組中在貼壁細(xì)胞孔內(nèi)加入200 μL僅含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。③將培養(yǎng)箱氧氣濃度調(diào)至1%，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS清洗3遍后加入250 μL/孔R(shí)IPA裂解液，同時(shí)反復(fù)吹打，提取細(xì)胞蛋白。根據(jù)ALP試劑盒說明書，按照不同分組分別將蛋白樣品加入96孔板內(nèi)，每孔30 μL，再分別加入基質(zhì)液和緩沖液各50 μL，37 ℃孵育15 min，加入顯色劑150 μL，酶標(biāo)儀檢測在520 nm波長下的吸光度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次，計(jì)量資料比較采用重復(fù)測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1牙髓細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，用改良組織塊酶消化法進(jìn)行原代牙髓細(xì)胞培養(yǎng)，原代培養(yǎng)第3天，可見牙髓細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，成放射狀，原代細(xì)胞培養(yǎng)14 d左右基本長滿，細(xì)胞呈長梭形，纖維狀。細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)呈放射狀或旋渦狀，生長匯合至80%時(shí)可進(jìn)行傳代。見圖1～4。

圖1 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天(倒置顯微鏡 ×200)

2.2低氧狀態(tài)下EPO對牙髓細(xì)胞增殖和分化的作用 低氧狀態(tài)下在濃度為20 U/mL的EPO分別作用于牙髓細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長下各孔的吸光度值，結(jié)果顯示：各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值實(shí)驗(yàn)組均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在酶標(biāo)儀測定520 nm波長下各孔的吸光度值，結(jié)果顯示：在24 h、48 h、72 h吸光度實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 低氧狀態(tài)下EPO對牙髓細(xì)胞增殖及分化的作用Table 1 Effect of EPO on dental pulp cell proliferation and differentiation under hypoxic condition

3 討 論

研究表明，缺氧直接影響MALAT1基因的轉(zhuǎn)錄。MALAT1通過缺氧控制著內(nèi)皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。此外，缺氧可誘導(dǎo)MiR-140-5p抑制細(xì)胞，降低細(xì)胞活力，加速細(xì)胞損傷和凋亡。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)[4-6]途徑在缺氧反應(yīng)中也起著重要作用，在缺氧條件下，HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核，與其亞基結(jié)合形成HIF-1，并與其他蛋白一起結(jié)合到miR-210[7]，引起缺氧反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞本身及其周圍組織的溶解、壞死。而缺氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)對EPO基因表達(dá)起著重要作用，缺氧誘導(dǎo)的核因子通過蛋白合成與EPO基因結(jié)合，從而促進(jìn)EPO基因的轉(zhuǎn)錄激活。研究已表明，EPO及受體在炎癥的牙髓組織中也會(huì)高度表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞缺氧時(shí)，EPO可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞功能，保護(hù)組織，減少損傷并促進(jìn)組織功能的恢復(fù)[8]。有學(xué)者指出，EPO以劑量依賴性方式影響著細(xì)胞生長，當(dāng)EPO濃度為20 U/mL時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出最大的活性。因此，本研究觀察低氧狀態(tài)下對牙髓細(xì)胞保護(hù)的EPO濃度設(shè)定為20 U/mL，結(jié)果顯示：無論在第24 h、48 h、72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對照組吸光度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明適當(dāng)濃度的EPO在低氧狀態(tài)下能促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖，對低氧狀態(tài)下的牙髓細(xì)胞有一定的保護(hù)作用?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是一種具有趨化活性的細(xì)胞因子，CXCR4是其唯一受體。在牙髓損傷修復(fù)過程中，SDF-1/CXCR4軸起著關(guān)鍵作用。研究也表明，EPO可以通過SDF-1調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的生長和遷移。EPO誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞后能顯著上調(diào)趨化因子CXCR4且SDF-1mRNA的表達(dá)水平，提示在缺氧狀態(tài)下EPO可能通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖。

EPO除了調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的生成外還具有多種生物學(xué)功能，但EPO對成骨分化的作用仍存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，EPO可以通過激活細(xì)胞微環(huán)境中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)釋放來增強(qiáng)破骨細(xì)胞的形成。此外，EPO已顯示在體外能夠刺激間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[9-11]，并增加了骨骼成骨細(xì)胞的形成和體內(nèi)成骨細(xì)胞的數(shù)量[12]，EPO在組織損傷時(shí)，也可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞[13]趨化，將其募集到損傷部位，參與新生血管形成[14]，并促進(jìn)細(xì)胞的分化表現(xiàn)出更高的ALP活性，加快組織損傷修復(fù)。Runx2是負(fù)責(zé)激活成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因，骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)參與控制礦化過程，出現(xiàn)在分化的后期，其特征是成熟成骨細(xì)胞系的細(xì)胞。此外，osterix(也稱為Sp7)是一種新型的含鋅的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞的分化，增殖和骨形成至關(guān)重要。EPO調(diào)節(jié)許多成骨因子的表達(dá)，包括Runx2、骨連接蛋白、骨橋蛋白、骨鈣素和ALP。Runx2、OCN和Osterix與間充質(zhì)干細(xì)胞分化的多個(gè)步驟密切相關(guān)。EPO可以上調(diào)Runx2、OCN和Osterix在基因和蛋白質(zhì)水平。同時(shí)EPO可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[15]的表達(dá)，而VEGF的表達(dá)水平與牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化和修復(fù)性牙本質(zhì)形成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在低氧狀態(tài)下以20 U/mL的EPO作為實(shí)驗(yàn)組作用于牙髓細(xì)胞，ALP結(jié)果顯示：在24 h、48 h、72 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組吸光度與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因可能是與藥物作用時(shí)間太短、選擇組數(shù)太少有關(guān)，使EPO對牙髓細(xì)胞分化作用不明顯，有待于今后進(jìn)一步的研究。

EPO是一種具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，在低氧環(huán)境下可誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞EPO的表達(dá)，從而提高牙髓細(xì)胞對低氧的耐受力，減輕牙髓組織的損傷。因此，將EPO用于缺氧狀態(tài)下保護(hù)牙髓細(xì)胞具有廣闊的前景。