產(chǎn)羥基喹啉基乙酮芽胞桿菌的篩選與分析

陳崢 劉波

摘 要：芽胞桿菌是一類重要的生防微生物，能產(chǎn)生多樣的抗菌物質(zhì)。為了挖掘產(chǎn)喹啉類抑菌物質(zhì)的菌株資源，以56個芽胞桿菌菌株為試驗材料，運用液相色譜四級桿飛行時間質(zhì)譜（LC-QTOF-MS）技術(shù)對其發(fā)酵產(chǎn)物進行檢測，對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分子特征提取和Metlin譜庫比對。結(jié)果表明：篩選獲得6株產(chǎn)羥基喹啉基乙酮（Quinacetol）的芽胞桿菌，分別是土壤芽胞桿菌FJAT14232（Bacillus soli）、枯草芽胞桿菌FJAT8784（Bacillus subtilis）、波茨坦短芽胞桿菌FJAT10006（Brevibacillus borstelensis）、浸麻類芽胞桿菌FJAT14204（Paenibacillus macerans）、嗜堿芽胞桿菌FJAT0014（Bacillus alcalophilus）和米氏解硫胺素芽胞桿菌FJAT14205（Aneurinibacillus migulanus）。6株芽胞桿菌中的羥基喹啉基乙酮占各自總代謝物的相對含量均高于1.17%，且與Metlin譜庫匹配得分均大于95.35。其中，土壤芽胞桿菌FJAT14232（Bacillus soli）中的羥基喹啉基乙酮相對含量最高，占其總代謝物相對含量的1.68%。嗜堿芽胞桿菌FJAT10014（Bacillus alcalophilus）的譜庫檢索得分最高，為99.13。本研究為微生物來源的喹啉類抑菌劑的開發(fā)與利用提供菌種資源和數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：羥基喹啉基乙酮;喹啉類;芽胞桿菌;抗菌化合物;液相色譜四級桿飛行時間質(zhì)譜

中圖分類號：S 476.1? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2021）04-0009-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.04.002

Screening and Analysis of Bacillus Producing Quinacetol

CHEN Zheng， Liu Bo*

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： Bacillus is an important biocontrol microorganism which can produce a variety of antimicrobial substances. In order to mine the strain resources producing the antibacterial substance quinolines， a total of 56 Bacillus strains were used as the experimental materials and their fermentation products were detected by the liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry （LC-QTOF-MS）， and the molecular characteristics were extracted from the mass spectrometric data and compared with the Metlin library. The results showed that， 6 strains of Bacillus producing quinacetol were screened and obtained， including Bacillus soli FJAT14232， Bacillus subtilis FJAT8784， Brevibacillus borstelensis FJAT10006， Paenibacillus macerans FJAT14204， Bacillus alcalophilus FJAT10014， Aneurinibacillus migulanus FJAT14205. The relative contents of quinacetol in the total metabolites of the six Bacillus strains were all higher than 1.17%， and the matching scores with Metlin library were all greater than 95.35. Among them， the relative content of quinacetol in Bacillus soli FJAT14232 was the highest， accounting for 1.68% of the relative content of its total metabolite， and Bacillus alcalophilus FJAT10014 had the highest score of 99.13 by library searching. This study could provide the strain resources and data support for the development and utilization of the quinoline bacteriostatic agent from microorganisms.

Key words： Quinacetol; Quinolines; Bacillus; Antimicrobial compound; Liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry

羥基喹啉基乙酮（Quinacetol），又名5乙?；?羥基喹啉、1（8羥基5喹啉）乙酮，CAS號為2598314，分子式是C11H9NO2，精確分子量為187.0630。羥基喹啉基乙酮具殺真菌活性，廣泛應用于殺菌劑中。羥基喹啉基乙酮的化學結(jié)構(gòu)特征是含有喹啉（C9H7N）骨架，屬于喹啉類化合物。喹啉類化合物是含氮雜環(huán)中一類非常重要化合物，具有多種優(yōu)良的藥理作用和生物活性，應用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)的多個領(lǐng)域[1-2]。在醫(yī)藥行業(yè)中，喹啉類化合物用于瘧疾、潰瘍、癌癥、HIV病毒和精神分裂等疾病的預防與治療

[3]。由于喹啉類化合物具有高效的殺菌[4-5]、殺蟲[5]和除草[3]作用，被開發(fā)用作農(nóng)藥產(chǎn)品。同時，喹啉類化合物是農(nóng)藥合成的重要方向，用作構(gòu)建新型結(jié)構(gòu)和先導化合物[6-7]，開發(fā)高效、低毒的喹啉類農(nóng)藥[8-9]。

目前，喹啉類化合物的來源主要通過人工化學合成[10-13]，而從微生物次級代謝產(chǎn)物中獲得喹啉類化合物的報道較少，如白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus[2，14]，然而芽胞桿菌產(chǎn)羥基喹啉基乙酮還未見報道。芽胞桿菌是一類重要的功能微生物[15]，具有拮抗多種微生物的特性。為了挖掘產(chǎn)喹啉類化合物的微生物資源，應用液相色譜四級桿飛行時間質(zhì)譜（LCQTOFMS）技術(shù)，篩選到能產(chǎn)羥基喹啉基乙酮的芽胞桿菌，為芽胞桿菌來源的喹啉類抑菌劑的開發(fā)與利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 芽胞桿菌菌株56株（表1），包括土壤芽胞桿菌FJAT14232（Bacillus soli）、枯草芽胞桿菌FJAT8784（Bacillus subtilis）、波茨坦短芽胞桿菌FJAT10006（Brevibacillus borstelensis）等，供試菌株于-80℃甘油保存。

1.1.2 試驗試劑 甲醇（色譜純，美國JT Baker公司），乙酸銨（色譜純，上海安譜科學儀器有限公司），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（美國BD公司），種子培養(yǎng)基（牛肉膏0.5%、蛋白胨0.3%、酵母粉0.5%、淀粉1.0%、氯化鈣0.5%、蔗糖1.0%、pH=7.0）。

1.1.3 試驗儀器 液相色譜四級桿飛行時間質(zhì)譜Agilent 1260/6520（美國安捷倫科技公司）;電子天平（瑞士梅特勒·托利多儀器有限公司）;恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器有限公司）;pH計（德國賽托利斯公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 芽胞桿菌菌株劃線培養(yǎng)活化24 h后，接入20 mL種子培養(yǎng)基， 于37℃ 200 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h， 成為種子液。按1%接種量接入50 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于 37℃ 200 r·min-1培養(yǎng)48 h，形成發(fā)酵液。每種芽胞桿菌發(fā)酵液各取50 mL， 經(jīng)離心后取上清液， 上清液過微孔濾膜（0.22 μm）后，加入樣品瓶。樣品制備后置于4℃冰箱保存，等待進樣。

1.2.2 樣品檢測 （1）色譜條件：色譜柱采用Agilent ZORBAX Extend C18（2.1 mm×50 mm， 1.8 Micron）;流動相為10 mmol·L-1乙酸銨水溶液（A相）和甲醇（B相）;梯度：0～8 min 5% B;38～45 min 95% B;47～55 min 5% B;流速：0.3 mL·min-1;柱溫：30℃;進樣量：2 μL;（2）質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式;干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：5 L·min-1;毛細管電壓：3500 V;裂解電壓：100 V;霧化器壓力：40 psig;Skimmer：65.0 V;質(zhì)量范圍：100～3000 m/z。

1.2.3 產(chǎn)羥基喹啉基乙酮芽胞桿菌的篩選 用LCQTOFMS對芽胞桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行分析，采用Agilent Mass Hunter軟件，對所獲得的數(shù)據(jù)進行分子特征提取（MFE），并通過Metlin代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得總體代謝物的信息。從中篩選產(chǎn)羥基喹啉基乙酮（Quinacetol）的菌株樣本。記錄保留時間、精確分子量、質(zhì)核比、相對含量和匹配得分等數(shù)據(jù)。

1.2.4 芽胞桿菌來源的羥基喹啉基乙酮成分分析 利用分子特征提取質(zhì)譜圖，根據(jù)電離模式、質(zhì)譜圖判斷加合離子類型，根據(jù)質(zhì)荷比推斷質(zhì)量數(shù)和分子式，并進一步計算樣品中測得的羥基喹啉基乙酮的精確分子量及質(zhì)量偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)羥基喹啉基乙酮芽胞桿菌的篩選

由表1可知，從56個芽胞桿菌菌株發(fā)酵液的代謝物中，篩選得到產(chǎn)羥基喹啉基乙酮的菌株有6株，分別為土壤芽胞桿菌FJAT14232（Bacillus soli）、枯草芽胞桿菌FJAT8784（Bacillus subtilis）、波茨坦短芽胞桿菌FJAT10006（Brevibacillus borstelensis）、浸麻類芽胞桿菌FJAT14204（Paenibacillus macerans）、嗜堿芽胞桿菌FJAT10014（Bacillus alcalophilus）和米氏解硫胺素芽胞桿菌FJAT14205（Aneurinibacillus migulanus）。

在與Metlin譜庫匹配度方面，匹配得分均大于95.35%，其中嗜堿芽胞桿菌FJAT10014（Bacillus alcalophilus）的譜庫檢索得分最高，為99.13%;而浸麻類芽胞桿菌FJAT14204（Paenibacillus macerans）的得分最低，為95.35%。

羥基喹啉基乙酮占各芽胞桿菌總代謝物的相對含量，均高于1.17%。其中，最高的為土壤芽胞桿菌FJAT14232（Bacillus soli），占其總代謝物相對含量的1.68%;而米氏解硫胺素芽胞桿菌FJAT14205（Aneurinibacillus migulanus）相對含量最低，占其總代謝物相對含量的1.17%。

2.2 芽胞桿菌來源的羥基喹啉基乙酮成分分析

芽胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中羥基喹啉基乙酮（Quinacetol）的提取化合物色譜圖，見圖1～2。在提取化合物色譜圖中，橫坐標代表保留時間（min），縱坐標則代表響應值。結(jié)果表明，土壤芽胞桿菌FJAT14232（Bacillus soli）的羥基喹啉基乙酮提取峰的響應值最高，為1.14×106;而米氏解硫胺素芽胞桿菌（Aneurinibacillus migulanus）FJAT14205的響應值最低，為7.40×105。

以枯草芽胞桿菌FJAT8784為例，利用分子特征提取羥基喹啉基乙酮的質(zhì)譜圖（圖3）。由于本試驗采用正離子的電離模式，該模式下產(chǎn)生[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+等分子離子。結(jié)合該化合物的鑒定結(jié)果（圖4），判斷質(zhì)荷比為205.0972的峰為[M+NH4]+加合離子，根據(jù)計算推斷該成分的質(zhì)量數(shù)為187.0638，分子式為C11H9NO2，為羥基喹啉基乙酮（Quinacetol）。

進一步計算芽胞桿菌樣品中測得的羥基喹啉基乙酮的精確分子量及質(zhì)量偏差，見表3。結(jié)果表明，質(zhì)量偏差分布范圍為-0.53×10-6～6.41×10-6。其中，偏差最小的為波茨坦短芽胞桿菌FJAT10006，為-0.53×10-6;而質(zhì)量偏差相對大的為土壤芽胞桿菌FJAT14232和浸麻類芽胞桿菌FJAT14204，實測值與理論值偏差都為6.41×10-6。

3 討論

喹啉類化合物是一類重要的含氮雜環(huán)，具有低毒、高效、對環(huán)境友好、結(jié)構(gòu)變化多樣等特點[7]。目前，以喹啉環(huán)為母核設(shè)計，合成新的抗菌化合物受到研究者關(guān)注，4羥基喹啉類、6羥基喹啉類、8羥基喹啉類、喹啉酰胺類、二氯喹啉酸類等衍生物研究較為深入[16]。然而，從天然產(chǎn)物中獲取喹啉類化合物的研究還較少，其中芽胞桿菌產(chǎn)喹啉類化合物還未見報道。

液相四級桿飛行時間質(zhì)譜（LCQTOFMS）技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率、高選擇性[17]的特點，本研究將該技術(shù)應用在微生物功能成分的檢測和篩選中。以芽胞桿菌屬及其近緣屬的56個菌株為樣本，篩選產(chǎn)喹啉類化合物的菌株資源。共獲得產(chǎn)羥基喹啉基乙酮（Quinacetol）的菌株6株，分別為土壤芽胞桿菌FJAT14232（相對含量為1.68%）、枯草芽胞桿菌FJAT8784（相對含量為1.53 %）、波茨坦短芽胞桿菌FJAT10006（相對含量為1.53%）、浸麻類芽胞桿菌FJAT14204（相對含量為1.39%）、嗜堿芽胞桿菌FJAT10014（相對含量為1.26%）和米氏解硫胺素芽胞桿菌FJAT14205（相對含量為1.17%）。羥基喹啉基乙酮相對含量的分布范圍為1.17%～1.68%，其中最高的是土壤芽胞桿菌FJAT14232，相對含量達到1.68%。采用分子特征提取（MFE）與Metlin譜庫檢索獲得化合物信息，6個樣本的譜庫得分（Score）均大于95.35，其中嗜堿芽胞桿菌FJAT10014的最高，得分為99.13。通過對羥基喹啉基乙酮精確分子量的檢測值與理論值計算質(zhì)量偏差，結(jié)果表明質(zhì)量偏差范圍為-0.53×10-6～6.41×10-6，滿足了高分辨質(zhì)譜的定性需求。

芽胞桿菌能產(chǎn)生豐富的抗菌物質(zhì)[18]，活性物質(zhì)和活性菌株的篩選有重要的應用價值。本研究為芽胞桿菌來源的抗菌化合物的開發(fā)與利用提供了一些前期基礎(chǔ)，然而羥基喹啉基乙酮的生物活性，還有待進一步分離、提純與生測。另外該成分是否為羥基喹啉基乙酮或是羥基喹啉基乙酮的同分異構(gòu)體， 有待進一步驗證。

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（責任編輯：柯文輝）