高效液相色譜法快速測(cè)定保健食品中葉黃素含量研究

＊解恒杰 徐立清 徐大瑋 穆文婕 張洪瀟 姜大勇 劉佩*

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 山東 250100 2.山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心 山東 250100）

前言

葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物中的天然物質(zhì)，屬于類胡蘿卜素的一種，是構(gòu)成人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的主要色素。葉黃素對(duì)視網(wǎng)膜中的黃斑有重要保護(hù)作用，是幫助眼睛發(fā)育的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，而且人體無法通過自身合成，必須靠攝入葉黃素來補(bǔ)充。新生兒眼睛中的高氧張力及視網(wǎng)膜中存在高濃度易氧化基質(zhì)，在光和光敏物質(zhì)作用下，嬰兒的視網(wǎng)膜更加容易受到氧化損害，葉黃素作為抗氧化劑，能夠有助保護(hù)視網(wǎng)膜免受氧化損害。在我國食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定調(diào)制乳粉中葉黃素含量在1620μg/kg-2700μg/kg，嬰兒配方食品和特殊膳食用食品中含量在300μg/kg-2000μg/kg，較大嬰兒和幼兒配方食品中含量在1620μg/kg-4230μg/kg，目前保健食品中葉黃素含量還沒有規(guī)定使用量。

目前檢測(cè)葉黃素的方法主要有分光光度法[1-3]，紫外分光光度計(jì)法[4]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]，薄層掃描法測(cè)定[6]，液相色譜法[7-10]。分光度法、紫外分光光度法和薄層掃描法樣品基質(zhì)易產(chǎn)生干擾，定性定量穩(wěn)定性差，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)于常量添加水平的葉黃素定量不準(zhǔn)確，高效液相色譜法穩(wěn)定性好，靈敏度高。樣品前處理方法主要有：丙酮直接提取法[11]；水溶解樣品后液液萃取法[12]；樣品皂化，蛋白酶酶解后進(jìn)行液液萃取；國家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于脂肪含量高的樣品經(jīng)氫氧化鉀溶液皂化后，再以乙醚-正己烷-環(huán)己烷（40+40+20，體積比）提取，液相色譜法分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。實(shí)際試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)皂化后加入混合萃取溶劑后離心時(shí)存在液液分層不明顯，不容易取出有機(jī)層；合并提取兩次提取液水洗后濃縮近干時(shí)較粘稠，不易濃縮近干。按照國標(biāo)前處理方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，效果不好，本文建立了快速簡(jiǎn)單的前處理方法，穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)材料與試劑

甲醇（色譜純），美國飛世爾公司；甲基叔丁基醚（色譜純），德國Merk公司；2,6-二叔丁基甲醚（分析純），中國天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純），中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純），中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀（分析純），中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度：≥98%），中國計(jì)量科學(xué)研究院；有機(jī)相濾膜，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

(2)儀器與試劑

Alliance 2695型高效液相色譜儀配2998型二極管陣列檢測(cè)器，美國Waters公司；BSA822-cw型電子天平，德國Sartorios公司；AB204-S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MS3基本型旋渦混合器，德國IKA公司；SB-800DTD型超聲波清洗器，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；Milli-Q超純水制備器，美國MILLIPORE公司；HGC-24型氮吹儀，中國HENGAO公司。

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

①校正標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品5mg（精確至0.01mg）于100mL容量瓶中，以0.1%BHT乙醇溶液配制成濃度約為50μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)樣校正用含0.1%BHT乙醇配制50μg/mL葉黃素標(biāo)樣，用甲醇稀釋得到10ug/mL標(biāo)樣，取1mL用甲醇定容至10mL，在波長(zhǎng)445nm下校正，校正公式：

式中，A-標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值；E-甲醇中葉黃素的吸光度系數(shù)，為2629dL/g；10-稀釋倍數(shù)；10000-換算系數(shù)（g/dL轉(zhuǎn)化為μg/mL）。

②配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

用移液管移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用甲醇（含0.1%BHT）依次稀釋成0.01ug/mL、0.05ug/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL、1.0ug/mL、2.0ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

(4)高效液相色譜條件

色譜柱：YMC C30，5μm，250mm×4.6mm；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：445nm；進(jìn)樣量：50μL；流動(dòng)相：甲醇（含0.1%BHT）-甲基叔丁基醚（含0.1%BHT）梯度洗脫，0-18min甲醇（含0.1%BHT）由95%～10%，18.1min甲醇（含0.1%BHT）變?yōu)?5%，保留10min。

(5)樣品處理方法

稱取2.00g樣品加0.2g BHT，加5mL 50%（質(zhì)量濃度）KOH，渦旋分散均勻，加10mL無水乙醇在35℃水浴振蕩45min，取出后冷至室溫，用無水乙醇定容至20mL搖勻，取5mL上述定溶液加1.8mL 6mol/L HCl（調(diào)pH至9），并用乙醇定容至10mL，過膜上機(jī)。經(jīng)0.22μm的有機(jī)濾膜過濾，濾液供高效液相色譜儀測(cè)定。

2.結(jié)果與討論

對(duì)質(zhì)量含量較高的樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，并對(duì)其中關(guān)鍵控制技術(shù)進(jìn)行研究抗氧化劑使用量、pH值和堿液濃度進(jìn)行深入研究，建立準(zhǔn)確測(cè)定高脂肪保健食品中葉黃素含量方法，該方法前處理簡(jiǎn)單快速，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

(1)BHT使用量的優(yōu)化

游離態(tài)葉黃素長(zhǎng)時(shí)間在空氣中暴露容易被氧化，會(huì)造成目標(biāo)物提取含量降低。因此在實(shí)驗(yàn)過程中需要加入抗氧化劑BHT，避免目標(biāo)物被氧化從而造成含量降低。BHT含量不同有不同的抗氧化作用，使用量太少起不到抗氧化的效果，含量太高容易造成試劑浪費(fèi)。在陰性樣品中添加葉黃素，分別加入0.05g、0.1g、0.2g、0.3g、0.5g BHT，葉黃素提取回收率如圖1所示，在BHT加入量小于0.2g時(shí)回收率較低，可能有存在部分目標(biāo)物被氧化，當(dāng)BHT加入量達(dá)到0.2g時(shí)回收率能達(dá)到近100%，大于0.2g時(shí)，回收率趨于穩(wěn)定，因此選擇抗氧化劑0.2g BHT最合適。

圖1 BHT使用量對(duì)葉黃素提取回收率的影響

(2)KOH濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)中皂化過程需要使用KOH，其作用是使脂肪生成脂肪酸鉀，容易溶解于水中，加入量的多少會(huì)直接影響提取效率。加入量過少，將會(huì)皂化反應(yīng)不完全，目標(biāo)物提取不充分，導(dǎo)致結(jié)果偏低。分別考察KOH質(zhì)量濃度為10%、30%、50%、70%和90%時(shí)，對(duì)陽性樣品中葉黃素皂化提取效率進(jìn)行研究，結(jié)果見圖2所示。當(dāng)KOH濃度低于50%時(shí)陽性樣品葉黃素提取效率低于60%，樣品并未完全被皂化，因此提取效率較低。當(dāng)KOH濃度達(dá)到50%以上時(shí)，樣品中葉黃素提取效率接近100%，樣品能夠被完全皂化，提取效率較高。因此選擇KOH濃度為50%作為樣品皂化條件。

圖2 KOH濃度對(duì)樣品中葉黃素提取效率影響

(3)pH值的優(yōu)化

為了考察葉黃素的穩(wěn)定性，試驗(yàn)了pH分別為3、5、7、9和12時(shí)，研究葉黃素含量提取效率，結(jié)果見圖3所示，當(dāng)pH大于等于9時(shí)，提取效率較高且穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，但當(dāng)pH為7時(shí)，葉黃素提取效率高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，皂化后的提取溶液調(diào)節(jié)pH值為9時(shí)，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

圖3 pH對(duì)樣品中葉黃素提取效率影響

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了考察葉黃素的穩(wěn)定性，分別對(duì)葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.06μg/mL）在18h內(nèi)每隔3h測(cè)定一次，記錄峰面及變化值結(jié)果見表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明標(biāo)注溶液和陽性樣品提取溶液在18h內(nèi)葉黃素響應(yīng)值沒有顯著變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.58%和0.24%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

表1 葉黃素溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

(5)方法學(xué)考察

①線性范圍和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照濃度從低到高依次經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，以葉黃素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制葉黃素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在0.02μg/mL～2.0μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：y=6.37×105x+1550，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999。本文采用加標(biāo)空白樣品基質(zhì)中標(biāo)樣對(duì)應(yīng)的響應(yīng)與背景噪音的比值（S/N=3）計(jì)算得到葉黃素的方法檢出限為10μg/100g，當(dāng)S/N=10時(shí)，方法定量限為40μg/100g。

②精密度

對(duì)不同保健食品添加165μg/100g，330μg/100g，660μg/100g三個(gè)含量水平標(biāo)物，每個(gè)含量水平重復(fù)6次，結(jié)果見表2所示。樣品含量在43-410μg/100g內(nèi)，回收率在87.9%-107%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%-3.5%范圍內(nèi)。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果（n=6）

3.結(jié)論

在高效液相色譜法測(cè)定高脂肪保健食品中葉黃素含量，對(duì)其中關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化；抗氧化劑使用量，KOH質(zhì)量濃度和pH優(yōu)化。通過對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)行考察，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件：抗氧化劑BHT使用量0.2g，皂化KOH堿溶液質(zhì)量濃度為50%，最佳pH提取溶液為9，在最優(yōu)條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取溶液18h內(nèi)含量穩(wěn)定。經(jīng)過驗(yàn)證，該方法適用于含乳保健食品中葉黃素含量的測(cè)定，前處理?xiàng)l件簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好。