基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討三七治療骨關(guān)節(jié)炎的有效活性成分及潛在作用機(jī)制

賴燕清

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院 龍巖364000）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritiis,OA）是臨床中最常見的一種骨退行性病變，臨床多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹以及活動(dòng)受限[1～3]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，全球范圍內(nèi)約有1.4億人患有OA[4]。目前OA治療并無靶向性藥物，早中期多使用非甾體類藥物干預(yù)，但存在明顯的胃腸道副反應(yīng)，因此只適合短期對(duì)癥治療[5～6]。中醫(yī)藥對(duì)于早中期OA有著良好的療效，在OA的治療中日益受到認(rèn)可[7]。三七是一味臨床上常見治療OA的中藥，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛的功效[8～9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，三七具有抗炎、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤等作用[10～11]。但三七對(duì)OA的作用機(jī)制，目前尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以利用現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)和生物信息學(xué)，從多成分、多靶點(diǎn)以及多通路的角度出發(fā)，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，探討多種中藥成分與疾病之間的相互作用機(jī)制。因此本研究擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，初步探討三七配伍對(duì)OA的作用機(jī)制，以期為后續(xù)研究提供理論參考。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 工具與方法

1.1 三七活血成分及潛在治療靶點(diǎn)收集 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）數(shù)據(jù)庫[12]對(duì)三七的活性成分進(jìn)行篩選。以利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，并將篩選后的活性成分使用TCMSP、草藥成分指標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Herbal Ingredients'Targets Database,HIT）[13]及PubChem數(shù)據(jù)庫查找相應(yīng)靶點(diǎn)，并使用Excel進(jìn)行整理。

1.2 OA治療靶點(diǎn)收集 使用治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database,TTD）[14]以 及GeneCards數(shù)據(jù)庫[15]收集OA潛在治療靶點(diǎn)，以“Osteoarthritis”為檢索詞，采用Excel將得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行整合。TTD數(shù)據(jù)庫即含有研究成功的臨床藥物靶點(diǎn)，也有目前在研的藥物靶點(diǎn)，且均經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，可信度較強(qiáng)。GeneCards通過整合網(wǎng)絡(luò)多個(gè)基因數(shù)據(jù)庫，含有所有關(guān)于人類的基因注釋信息和預(yù)測(cè)信息，信息較全。

1.3 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 將三七有效活性成分相應(yīng)靶點(diǎn)以及OA治療靶點(diǎn)進(jìn)行合并，取其交集，即為三七-OA潛在治療靶點(diǎn)。以三七有效成分和三七-OA潛在治療靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，在Excel表格中建立藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中建立三七活性成分與OA治療靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 KEGG通路以及GO富集分析 將三七-OA潛在治療靶點(diǎn)在David網(wǎng)站[16]進(jìn)行KEGG（京都基因與基因組百科全書）通路富集分析以及基因本體（Gene Ontology,GO）生物過程富集分析，GO分析包括生物學(xué)過程（Biological Process,BP）、細(xì)胞組分（Cellular Component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）三個(gè)部分。使用R語言對(duì)P值進(jìn)行校正并選擇前10個(gè)分析結(jié)果進(jìn)行氣泡圖展示，進(jìn)一步探討三七治療OA的潛在作用機(jī)制。

1.5 關(guān)鍵基因鑒定以及子模塊分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫[17]對(duì)三七-OA治療靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），隨后使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。具有最高自由度的基因被認(rèn)為是關(guān)鍵基因。對(duì)三七-OA共靶向基因進(jìn)行模塊分析，使用MCODE插件進(jìn)行子模塊分析，子模塊納入標(biāo)準(zhǔn)如下：MCODE評(píng)分＞5，節(jié)點(diǎn)數(shù)量＞10，并對(duì)模塊分析結(jié)果進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 三七活血成分及潛在治療靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以口服OB≥30%以及DL≥0.18為篩選條件，檢索到8種三七有效成分，其中包括β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素以及人參皂苷等。見表1。將檢索到的有效成分在TCMSP及HIT數(shù)據(jù)庫上收集相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，Excel整理查重后共有186個(gè)治療靶點(diǎn)。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中三七有效成分

2.2 三七治療骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn) 通過檢索TTD以及GeneCards數(shù)據(jù)庫，Excel整理取出重復(fù)值，共篩選出骨關(guān)節(jié)炎潛在治療靶點(diǎn)1 282個(gè)。將三七治療靶點(diǎn)與骨關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)進(jìn)行匹對(duì)，共發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)88個(gè)。見圖1。

圖1 三七治療OA靶點(diǎn)

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 將三七的每個(gè)有效成分和其相對(duì)應(yīng)治療靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，繪制成分-靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)圖形，以紅色倒三角形代表三七活性成分，黃色圓形代表潛在治療靶點(diǎn)。結(jié)果顯示三七中主要活性成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷Rh2、食脂素、亞油酸乙酯以及槲皮素，而其中最主要的三個(gè)活性成分為β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素。見圖2。

圖2 “三七-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG通路富集分析 將關(guān)鍵靶基因在David網(wǎng)站中進(jìn)行KEGG通路富集，共富集顯著性通路101條。使用R語言對(duì)P值進(jìn)行校正并選擇前10條通路進(jìn)行氣泡圖展示。結(jié)果顯示三七治療OA的信號(hào)通路主要富集在腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、凋亡以及缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路等。見圖3。

圖3 三七-OA共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

2.5 GO富集分析 將獲得的三七-OA共同靶點(diǎn)放入David網(wǎng)站上進(jìn)行GO富集分析，選擇生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）以及細(xì)胞組分（CC）三個(gè)內(nèi)容。結(jié)果顯示三七-OA共同靶點(diǎn)在BP上主要富集在藥物反應(yīng)、衰老、缺氧反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程上；在MF上主要富集在酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)合以及細(xì)胞因子活性等分子功能上；在CC上主要位于細(xì)胞外間隙、胞膜以及細(xì)胞質(zhì)中。見圖4～圖6。

圖4 三七-OA共同靶點(diǎn)GO-BP富集分析結(jié)果

圖5 三七-OA共同靶點(diǎn)GO-MF富集分析結(jié)果

圖6 三七-OA共同靶點(diǎn)GO-CC富集分析結(jié)果

2.6 關(guān)鍵基因以及子模塊分析 三七-OA共同靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖7所示，自由度前3個(gè)基因分別為IL-6、TNF以及AKT1，被認(rèn)為是關(guān)鍵基因。MCODE插件發(fā)現(xiàn)子模塊1個(gè)，含有45個(gè)節(jié)點(diǎn)、780條邊，如圖8A所示。使用David數(shù)據(jù)庫對(duì)子模塊進(jìn)行KEGG分析，子模塊基因主要富集在TNF信號(hào)通路以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。見圖8B。

圖7 三七-OA共同靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖8 子模塊分析以及KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討論

隨著我國老齡化社會(huì)程度加重，我國OA患者呈逐年增加趨勢(shì)。OA的主要病理表現(xiàn)有滑膜炎癥、軟骨損傷以及軟骨下骨的反應(yīng)性增生[18]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，OA是導(dǎo)致下肢殘疾的十大原因之一[19]。關(guān)節(jié)置換術(shù)被認(rèn)為是治療終末期OA的黃金方法，但其仍然存在療效不滿意、并發(fā)癥高、感染、返修等不足[20]。因此如何延緩早中期OA患者過早進(jìn)展成重度OA，延緩初次關(guān)節(jié)置換年齡一直是骨科醫(yī)師研究的重點(diǎn)。

中醫(yī)藥在早中期OA治療中的療效一直受到認(rèn)可[7,21]。OA屬于中醫(yī)學(xué)痹病范疇，多由于素體正氣不足，腠理不密，衛(wèi)外不固，外邪入侵可使津血運(yùn)行不暢，氣滯血瘀，不通則痛；此外長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可進(jìn)一步損傷肝腎，導(dǎo)致肝腎虧虛，筋脈失養(yǎng)，不榮則痛。三七有化瘀止血、活血定痛功效，對(duì)于早中期OA患者，可以有效促進(jìn)血液運(yùn)行，避免氣滯血瘀，延緩早中期OA患者過早進(jìn)展成重度OA。戶紅卿等[9]的研究結(jié)果顯示，三七結(jié)合針灸可以有效改善血瘀型膝原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀；喬登朝等[22]的研究結(jié)果也顯示三七可以有效抑制創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)滑膜炎，抑制患者疼痛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果也顯示三七總皂苷可以有效抑制關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而達(dá)到抑制滑膜炎、改善患肢功能的療效[10]。此外，三七總皂苷聯(lián)合白芍總苷具有抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α含量，并抑制滑膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α等表達(dá)的作用[23]，然而三七對(duì)于OA的作用機(jī)制，目前尚不明確。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā)，探討三七治療OA的潛在治療機(jī)制。本研究共檢索出三七8種有效治療成分，映射治療OA靶標(biāo)88個(gè)。在“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)有3種有效成分最為顯著，即β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素。GO富集結(jié)果顯示三七-OA共同靶點(diǎn)主要富集在藥物反應(yīng)、衰老、缺氧反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程上，提示三七可以有效抑制OA炎癥，這與之前的文獻(xiàn)結(jié)果也是相符的[10，23]。KEGG通路富集結(jié)果顯示三七治療OA的信號(hào)通路主要富集在TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、凋亡以及HIF-1信號(hào)通路等。TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路與炎癥、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能密切相關(guān)，進(jìn)一步提示三七對(duì)于OA炎癥的抑制作用。此外，PPI網(wǎng)絡(luò)顯示三七治療OA的前3個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镮L-6、TNF以及AKT1，且子模塊KEGG通路富集分析結(jié)果也顯示主要富集在TNF信號(hào)通路上，提示三七治療OA可能與TNF炎癥信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，本研究以經(jīng)典中藥三七為研究對(duì)象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)，探討三七治療OA的有效活性成分、潛在靶點(diǎn)以及相關(guān)信號(hào)通路，構(gòu)建藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行KEGG和GO富集分析，闡述三七治療OA的潛在作用機(jī)制。結(jié)果顯示三七治療OA最主要的三個(gè)活性成分為β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素；三七治療OA主要涉及炎癥反應(yīng)、衰老、缺氧等生物學(xué)過程；三七治療OA主要通過腫瘤壞死因子信號(hào)通路、衰老以及Toll樣受體相關(guān)通路等；三七治療OA前3位關(guān)鍵基因?yàn)镮L-6、TNF、AKT1。