綜合生物信息學(xué)探究RNA結(jié)合蛋白對(duì)腎乳頭癌預(yù)后的影響

陳 趙，檀飛飛，劉同族

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430071)

腎細(xì)胞癌(renal cell cancer，RCC)是泌尿系統(tǒng)高發(fā)的疾病之一，主要有5大分型，腎乳頭癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)是其發(fā)病率第2的分型。RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)是一種在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)合蛋白，它與多種編碼或非編碼RNA結(jié)合，對(duì)細(xì)胞的生長起調(diào)節(jié)作用。RBPs在人多種癌癥中被證明與預(yù)后相關(guān)，而在KIRP中的研究缺乏，故筆者就RBPs對(duì)腎乳頭癌的預(yù)后影響進(jìn)行了探究，報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載與處理從TCGA數(shù)據(jù)庫下載人腎乳頭癌基因表達(dá)樣本321個(gè)，包括32個(gè)正常樣本和289個(gè)腫瘤樣本，并提供相應(yīng)的臨床信息。從GER等[1]的一次人類普查中收集了RBPs，總共獲得了1 542個(gè)RBPs基因(表1)。原始數(shù)據(jù)采用limma軟件包進(jìn)行預(yù)處理。使用函數(shù)wilcox.test進(jìn)行差異表達(dá)篩選，差異表達(dá)的RBPs以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false detection rate，F(xiàn)DR)<0.05和|logFC|≥0.5納入，F(xiàn)C為差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)。其中133個(gè)下調(diào)基因，259個(gè)上調(diào)基因(圖1)。

A:熱圖;B：下調(diào)基因的火山圖。

1.2 GO、KEGG富集分析使用R包“clusterProfiler”對(duì)差異基因進(jìn)行了GO、KEGG富集分析，P<0.05被設(shè)為閾值標(biāo)準(zhǔn)，并使用R包“GOplot”對(duì)這些富集的結(jié)果進(jìn)行了可視化處理。

1.3 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作和可視化處理使用String(檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具)檢測(cè)了所有差異表達(dá)的RBPs之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(https://string-db.org/)，并使用Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 RBPs預(yù)后基因的篩選和預(yù)后模型的構(gòu)建通過基于生存時(shí)間和生存狀態(tài)對(duì)差異基因進(jìn)行了單因素Cox分析，通過kmPfilter<0.01篩選出預(yù)后相關(guān)的RBPs基因。對(duì)預(yù)后相關(guān)的RBPs基因進(jìn)行多因素Cox分析篩選出獨(dú)立預(yù)后的RBPs基因，并建立了預(yù)后模型，隨后對(duì)模型進(jìn)行生存分析，繪制風(fēng)險(xiǎn)曲線、受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線。

1.5 預(yù)后基因的免疫組化驗(yàn)證為了進(jìn)一步確定這些獨(dú)立預(yù)后基因在KIRP中的表達(dá)，使用了人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫中的免疫組化結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 GO富集分析GO富集分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過程中，上調(diào)的差異基因(圖2A、C)主要富集在ncRNA代謝過程、核糖核蛋白復(fù)合物的生物發(fā)生、ncRNA處理、RNA剪接。下調(diào)的差異基因(圖2B、D)主要富集在翻譯的調(diào)節(jié)、RNA剪接、細(xì)胞酰胺代謝過程的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞成分中，上調(diào)的差異基因主要富集在核糖體亞基、核糖體、大核糖體亞基；下調(diào)的差異基因主要富集在細(xì)胞質(zhì)核糖核蛋白顆粒。在分子功能中，上調(diào)的差異基因主要富集在催化活性，作用于RNA、核糖體的結(jié)構(gòu)成分；下調(diào)的基因主要富集在催化活性，作用于RNA、翻譯調(diào)節(jié)器活動(dòng)。

A、B：上調(diào)的差異基因GO富集分析結(jié)果；C、D：下調(diào)的差異基因GO富集分析結(jié)果。

2.2 KEGG富集分析KEGG富集分析得出上調(diào)的差異基因(圖3A、C)主要富集在核糖體、剪接體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)中，下調(diào)的差異基因(圖3B、D)主要富集在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA監(jiān)測(cè)途徑中。

A、C：上調(diào)差異基因的KEGG富集分析結(jié)果；B、D：下調(diào)差異基因的KEGG富集分析結(jié)果。

2.3 PPI互作網(wǎng)絡(luò)為進(jìn)一步探索這些差異基因的潛在分子功能及分子間相互作用，將差異基因?qū)雜tring數(shù)據(jù)庫并用cytoscope可視化構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，為方便展示，我們篩選了連接度大于20的進(jìn)行展示，可以發(fā)現(xiàn)部分基因蛋白的相互作用預(yù)測(cè)關(guān)系(圖4)。

A:所有差異基因蛋白的相互作用；B：3個(gè)子網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用。

2.4 四個(gè)獨(dú)立預(yù)后RBPs基因的Cox分析單因素Cox、多因素Cox分析篩選出PIWIL1、DALRD3、DNMT3B、TERT 4個(gè)獨(dú)立預(yù)后RBPs基因。其中DALRD3是低風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)后基因，PIWIL1、DNMT3B、TERT是高風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)后基因(圖5)。預(yù)后模型的生存分析得出高風(fēng)險(xiǎn)的患者其5年生存率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于低風(fēng)險(xiǎn)的患者，用于內(nèi)部驗(yàn)證的train組ROC曲線面積為0.944，外部驗(yàn)證的test組ROC曲線面積為0.955，說明了該預(yù)后模型具有很高的預(yù)測(cè)價(jià)值(圖6)。風(fēng)險(xiǎn)曲線分析結(jié)果表明，根據(jù)模型評(píng)分，得分越高其生存率越低，反之亦然(圖7)。

A:28個(gè)RBPs基因的單因素Cox分析;B:6個(gè)RBPs基因的多因素Cox分析。

2.5 免疫組化和生存分析最后使用免疫組化展示了4個(gè)預(yù)后RBPs基因在腫瘤和正常組織中的蛋白表達(dá)水平?？梢钥闯?個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)的基因(PIWIL1、DNMT3B、TERT)在腫瘤組織中的表達(dá)要明顯高于正常組織，低風(fēng)險(xiǎn)基因(DALRD3)在正常組織中的表達(dá)要高于腫瘤組織。同時(shí)我們還對(duì)4個(gè)預(yù)后基因進(jìn)行了生存分析，結(jié)果表明在高風(fēng)險(xiǎn)的基因中表達(dá)水平越高生存率越低，而低風(fēng)險(xiǎn)的基因則顯示出了相反的結(jié)果(圖8)。

根據(jù)train組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值劃分高低風(fēng)險(xiǎn)組；A：train組高低風(fēng)險(xiǎn)組生存分析；B：train組ROC曲線；C：test組高低風(fēng)險(xiǎn)組生存分析；D：test組ROC曲線。

A：train組預(yù)后基因的熱圖；B：train組風(fēng)險(xiǎn)曲線；C：test組預(yù)后基因熱圖；D：test組風(fēng)險(xiǎn)曲線。

A：PIWIL1基因；B：DALRD3基因；C：DNMT3B基因；D：TERT基因。

3 討 論

RCC是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有癌癥的3%[2]。KIRP的發(fā)病率僅次于腎透明細(xì)胞癌。KIRP起源于腎近端的小管細(xì)胞[3]，其分為兩個(gè)亞型，1型預(yù)后相對(duì)較好，2型預(yù)后較差[4]。目前關(guān)于RCC的治療還是以手術(shù)為主，但是臨床上大約有30%的RCC患者會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[5]。對(duì)于轉(zhuǎn)移的RCC來說手術(shù)治療效果不佳，近年來關(guān)于預(yù)后標(biāo)志物在設(shè)計(jì)診斷和預(yù)后測(cè)試方面研究越來越重視，預(yù)后標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)于RCC的治療來說具有重要的意義。

RBPs是一種可以和多種RNA結(jié)合的蛋白，可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，主要的作用是對(duì)RNA的加工，如對(duì)mRNA的剪接和對(duì)翻譯的調(diào)節(jié)等[6]。在過去的幾十年，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)RBPs與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間有著密切的關(guān)系[7-8]。因此本研究對(duì)KIRP和RBPs之間的關(guān)系進(jìn)行了深入分析。

本文通過分析得出PIWIL1、DALRD3、DNMT3B、TERT這4個(gè)獨(dú)立預(yù)后的RBPs基因。其中PIWIL1是PIWI亞家族的成員，該蛋白在進(jìn)化上是相對(duì)保守的蛋白，一項(xiàng)Meta分析的研究表明PIWIL1和多種癌癥的表達(dá)有相關(guān)性，其表達(dá)量越高患者的死亡率越高，且該研究還表明PIWIL1表達(dá)量越高的患者，其術(shù)后復(fù)發(fā)率越高[10]。SHI等[11]研究發(fā)現(xiàn)敲除PIWIL1基因可以大幅減少胃癌的轉(zhuǎn)移。我們推測(cè)其有可能成為KIRP預(yù)后標(biāo)志物。DALRD3基因目的作用及功能國內(nèi)外還沒有定論，本研究發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)低風(fēng)險(xiǎn)基因，即其表達(dá)量越高患者的生存率越高，對(duì)于腫瘤患者來說是一個(gè)保護(hù)因素。DNMT3B是一個(gè)維持甲基轉(zhuǎn)移的酶，參與DNA甲基化以調(diào)節(jié)正常的生物學(xué)功能，其功能的異常通常與腫瘤的發(fā)生相關(guān)[12]。ZHU等[13]研究發(fā)現(xiàn)DALRD3通過調(diào)控RAD9表達(dá)來促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。還有研究表明DNMT3B的表達(dá)與黏液表皮樣癌的增殖有關(guān)[14]。結(jié)合我們的研究分析，DNMT3B有望成為KIRP的預(yù)后標(biāo)志物。TERT是一種端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄的酶，生物學(xué)功能就是維持染色體的穩(wěn)定，表達(dá)的失調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)[15]。JUN等[16]研究發(fā)現(xiàn)TERT的表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于黑色素瘤來說，TERT突變的男性患者免疫治療的效果可能會(huì)更好[17]。這也給我們提供了新的思路，免疫和RBPs聯(lián)合分析可能會(huì)更加精確KIRP的治療靶點(diǎn)。

我們首創(chuàng)的KIRP-RPBs預(yù)后預(yù)測(cè)模型結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分越高的患者，其5年的生存率越低。對(duì)于本模型做了獨(dú)立預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)其可以作為獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。也就是說患者可以通過我們的模型計(jì)算出其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，能夠初步計(jì)算出其5年生存率。盡管在每個(gè)步驟中都進(jìn)行了嚴(yán)格的設(shè)計(jì)和過濾標(biāo)準(zhǔn)，但本研究仍存在一些局限性。首先，本研究?jī)H納入了TCGA數(shù)據(jù)庫且樣本量較少。應(yīng)該多中心，大量的納入樣本以確保研究的客觀性。其次，我們的實(shí)驗(yàn)僅僅是數(shù)據(jù)分析層面，應(yīng)加以實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

總之，我們通過一系列生物信息學(xué)分析得出了4個(gè)KIRP預(yù)后相關(guān)的RBPs，這4個(gè)基因有望成為KIRP潛在的生物預(yù)后標(biāo)志物，并且我們還建立了KIRP患者的預(yù)后預(yù)測(cè)模型，希望本研究可以為臨床靶向治療KIRP提供一定的理論依據(jù)。