液相懸浮陣列芯片在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展*

李 敏，豆小文，熊 丹 綜述，張秀明△ 審校

1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,安徽淮南 232000；2.深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室/深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,廣東深圳 518001

隨著疾病精準(zhǔn)診療需求提升，對(duì)于疑難性疾病，單一指標(biāo)往往無(wú)法實(shí)現(xiàn)疾病的精準(zhǔn)診斷，多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)早已成為臨床檢驗(yàn)的常態(tài)。蛋白或基因芯片的產(chǎn)生為快速、準(zhǔn)確、高效的臨床診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供了重要的技術(shù)手段。液相懸浮陣列芯片作為其中之一，已廣泛應(yīng)用于微生物鑒定[1]、腫瘤標(biāo)志物檢查[2]、藥物篩選[3-5]等領(lǐng)域。

20世紀(jì)90年代后期，液相懸浮陣列芯片技術(shù)作為后基因組新興分子生物學(xué)檢測(cè)芯片技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)[6-8]，其是集基因芯片、流式細(xì)胞技術(shù)、激光分析以及數(shù)字信號(hào)處理等于一體的新技術(shù)。將小分子物質(zhì)(如抗體、抗原、核酸探針等)致密地排列于特定載體微球(表面有不同的基團(tuán)修飾，如羧基、羥基、生物素、鏈霉親和素等)上，利用分子間特異親和反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因、配體、抗原等活性物質(zhì)分析，從而達(dá)到多元檢測(cè)生物活性物質(zhì)(超1 100種)或診斷多種疾病的目的。即可該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于所需樣本量?jī)H微量足矣(10～50 μL)、適用樣本種類多且可同時(shí)定量多靶標(biāo)等[9-10]。液相懸浮陣列芯片技術(shù)的首個(gè)商品化產(chǎn)品——靈活的多組分分析分子診斷技術(shù)平臺(tái)(xMAP)由美國(guó)Luminex公司研制成功，并通過(guò)了美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)認(rèn)證，于2005年度榮獲國(guó)際臨床診斷技術(shù)革新獎(jiǎng)[11]。隨著該技術(shù)的發(fā)展，其已呈現(xiàn)出廣泛的臨床檢測(cè)應(yīng)用前景。

1 液相懸浮陣列芯片技術(shù)原理

液相懸浮陣列芯片技術(shù)是基于xMAP技術(shù)和xTAG技術(shù)(二者均屬于Luminex公司)，核心采用載體編碼微球?qū)Υ龣z測(cè)目標(biāo)物進(jìn)行識(shí)別，載體編碼微球材料主要為聚苯乙烯、光子晶體等，微球直徑一般5.6 μm，表面標(biāo)記不同熒光染料。

xMAP技術(shù)核心是將聚苯乙烯微球用不同比例的橙色和紅色熒光染料染色，根據(jù)二者熒光的比例不同可染成不同濃度的微球，還可添加第3種熒光染料，增加熒光編碼微球的數(shù)量。不同熒光編碼微球上共價(jià)偶聯(lián)相應(yīng)的探針，混合在同一體系，再加入待測(cè)樣本。在液相懸浮溶液中，待測(cè)物質(zhì)被熒光編碼微球上的探針識(shí)別并結(jié)合，結(jié)合了待測(cè)物質(zhì)的熒光編碼微球一一排成單列被鞘液傳送系統(tǒng)傳送，依次被紅色和綠色激光激發(fā)。紅色激光用來(lái)激發(fā)熒光編碼微球本身的熒光，來(lái)識(shí)別微球的種類；綠色激光則用來(lái)激發(fā)報(bào)告分子攜帶的熒光，通過(guò)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的定量分析[11]。xTAG是xMAP 技術(shù)的延伸，應(yīng)用了Luminex專用的通用標(biāo)簽，利用標(biāo)簽和反標(biāo)簽序列的互補(bǔ)配對(duì)對(duì)核酸試驗(yàn)優(yōu)化改進(jìn)。運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增待檢測(cè)物質(zhì)的核酸，其產(chǎn)物與TAG引物混合，若存在目標(biāo)核酸，則目標(biāo)引物延伸并摻加入標(biāo)記物，然后將帶有反TAG序列的微球加入反應(yīng)體系中，微球通過(guò)專一的互補(bǔ)配對(duì)來(lái)識(shí)別目標(biāo)引物。檢測(cè)鞘液系統(tǒng)中目標(biāo)引物標(biāo)記的熒光信號(hào)即可獲得分析結(jié)果[8]。隨著微球編碼技術(shù)、解讀編碼微球設(shè)備及編碼微球制備工藝改進(jìn)，新型液相懸浮陣列芯片技術(shù)已在臨床檢驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮了愈加重要的作用。

2 微球編碼技術(shù)類型

編碼微球作為液相懸浮陣列芯片技術(shù)關(guān)鍵元件之一，目前以Luminex公司和BD公司的cytometric珠陣列系統(tǒng)[12]等商業(yè)化有機(jī)熒光染料編碼微球?yàn)橹?。此類微球?yīng)用范圍最為廣泛，但存在一些缺陷：(1)有機(jī)熒光染料發(fā)射光譜易與常用定量標(biāo)記物發(fā)生干擾[13-14]，前者往往具有較寬的發(fā)射光譜；(2)有機(jī)熒光染料吸收光譜比較窄，檢測(cè)中需多束激光激發(fā)，成本較高[15]；(3)有機(jī)熒光染料易發(fā)生光漂白，不利于臨床應(yīng)用。為了彌補(bǔ)有機(jī)熒光編碼微球的不足，越來(lái)越多的學(xué)者不斷研發(fā)出各種功能性納米顆粒編碼微球。

2.1上轉(zhuǎn)換熒光納米材料編碼微球 稀土摻雜上轉(zhuǎn)換熒光納米編碼微球是采用絡(luò)合共沉淀法、溶劑熱法或熱分解法摻雜Yb3+-Er3+、Yb3-Tm3+離子的β-NaYF4合成的編碼微球，可以在低能量下實(shí)現(xiàn)反Stokes發(fā)光，并在二極管近紅激光器激發(fā)下發(fā)出可見(jiàn)光(半高寬多發(fā)射峰小)[16-17]。相比于有機(jī)熒光染料，上轉(zhuǎn)換納米材料具有耐光漂白、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，因此上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒更適合用來(lái)編碼熒光微粒[18-20]。上轉(zhuǎn)換納米顆粒的多色發(fā)光是其待克服難題之一，有學(xué)者研究單發(fā)射峰上轉(zhuǎn)換納米材料可克服其劣勢(shì)，為該編碼材料臨床應(yīng)用提供了可能[21-24]。

2.2量子點(diǎn)(QDs)編碼熒光微球 QDs又稱半導(dǎo)體納米顆粒，具有獨(dú)特光學(xué)特性：(1)同一激光可激發(fā)不同粒徑QDs，具有較寬激發(fā)光譜；(2)改變QDs形狀和化學(xué)組成可調(diào)節(jié)其發(fā)射光譜分布于整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)；(3)具有較大Stokes位移，避免激發(fā)和發(fā)射光譜的信號(hào)重疊；(4)QDs效率高、熒光壽命長(zhǎng)、生物相容性強(qiáng)等。QDs的編碼數(shù)量可利用公式實(shí)現(xiàn)多色編碼[25]。與有機(jī)熒光染料相比，雖然二者均采用短波長(zhǎng)激發(fā)光，在檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生較強(qiáng)背景噪聲，但QDs熒光壽命較長(zhǎng)，故QDs編碼微球可通過(guò)時(shí)間分辨免疫與因短波激光產(chǎn)生的強(qiáng)背景干擾分開，實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)的目的。

2.3熒光壽命編碼微球 熒光壽命是熒光染料的內(nèi)參數(shù)[26]，將不同熒光壽命的靶向QDs混合，通過(guò)改變其組成比例，可獲得不同熒光壽命編碼微球，其編碼信息量大，是液相懸浮陣列芯片實(shí)現(xiàn)多元和特定分析的優(yōu)異載體。由于流式細(xì)胞儀鞘液系統(tǒng)所需激光器一般3個(gè)以上，采用多元熒光壽命編碼微球檢測(cè)成本高，如何降低該載體的應(yīng)用成本是未來(lái)需解決的核心問(wèn)題。

2.4表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(SERS)編碼微球 SERS由吸附于粗糙貴金屬Au、Ag、Cu等表面上吡啶分子實(shí)現(xiàn)液相體系中拉曼散射信號(hào)約6個(gè)數(shù)量級(jí)以上的信號(hào)增強(qiáng)[12，27]，已廣泛應(yīng)用于生物傳感器和生物成像等技術(shù)。SERS具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)拉曼譜帶線寬極窄(約1 nm)，具有較強(qiáng)編碼能力；(2)靈敏度高，可以對(duì)單分子進(jìn)行檢測(cè)；(3)拉曼散射壽命短，防止了其能量轉(zhuǎn)移、光褪色等，信號(hào)穩(wěn)定性好；(4)所需激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬。值得注意的是，在液相懸浮陣列芯片系統(tǒng)中，SERS信號(hào)易與熒光信號(hào)重疊，因此需謹(jǐn)慎選擇適宜的熒光標(biāo)記分子和拉曼分子。

2.5結(jié)構(gòu)色編碼微球 通過(guò)納米粒子有序組裝結(jié)構(gòu)對(duì)光的反射和干涉，產(chǎn)生的一系列結(jié)構(gòu)色的光子晶體(即電解質(zhì)周期性排列結(jié)構(gòu))，也可作為編碼微球載體。光子晶體材料的結(jié)構(gòu)周期性和折射率決定反射光的波長(zhǎng)。由布拉格方程可知，光子晶體材料的顏色不易被漂白，且可調(diào)節(jié)。相比熒光編碼微球，結(jié)構(gòu)色編碼微球(光子晶體)具有較好的穩(wěn)定性和極低的檢測(cè)成本，在臨床疾病的診斷中有著強(qiáng)大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

3 液相懸浮陣列芯片在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用研究

3.1病原體檢測(cè) 隨著新型分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，熒光定量PCR、基因芯片、液相懸浮陣列芯片技術(shù)等已廣泛應(yīng)用于病原體感染監(jiān)測(cè)，見(jiàn)表1。液相懸浮陣列芯片可通過(guò)一次篩查即可實(shí)現(xiàn)快速、高效、特異、靈敏的多種病原體鑒別診斷，為臨床精準(zhǔn)醫(yī)療決策提供可靠指導(dǎo)。

WANG等[25]基于新城疫病毒(NDV)蛋白和禽流感病毒(AIV)核蛋白包覆納米磁珠，采用1∶200最佳血清稀釋比建立雙相xMAP法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)NDV和AIV抗體，相比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)靈敏度分別提高16和1 024倍。MARTIEZ-VENDRELL等[28]構(gòu)建qSAT multiplex面板檢測(cè)全血、血漿中惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白2(PfHRP2)和瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)，所測(cè)PfHRP2和pLDH結(jié)果與定量PCR和顯微鏡測(cè)定的寄生蟲密度呈正相關(guān)關(guān)系，表明該法可預(yù)測(cè)寄生蟲密度。液相懸浮陣列芯片技術(shù)不僅可定量檢測(cè)病原體的抗原、抗體和核酸，還可定性鑒定病原體的血清分型。見(jiàn)表1。

表1 液相懸浮陣列芯片技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

3.2自身免疫疾病標(biāo)志物檢測(cè) 自身免疫性疾病在機(jī)體細(xì)胞受疾病刺激下可合成分泌具有生物學(xué)活性的小分子物質(zhì)如抗核抗體譜、糖尿病譜、自免肝譜等，是疾病發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后的良好指標(biāo)，其檢測(cè)主要依賴ELISA、化學(xué)發(fā)光法，但這2種方法無(wú)法解決醫(yī)院多項(xiàng)目通量難題，當(dāng)單項(xiàng)目標(biāo)本量較小時(shí)，存在開瓶穩(wěn)定性和試劑浪費(fèi)問(wèn)題，懸浮陣列芯片可多因子組合檢測(cè)，且具有高通量?jī)?yōu)勢(shì)，是自免標(biāo)志物檢測(cè)的有力技術(shù)平臺(tái)。

GUO等[33]首次報(bào)道了利用懸浮陣列技術(shù)實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的多路發(fā)光氧通道免疫分析平臺(tái)，設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的由QDs主珠(QDH)和位點(diǎn)受體珠(ABs)組成的主-客體雙功能條碼，QDH提供高編碼容量的功能，ABs促進(jìn)發(fā)光氧通道免疫分析的功能。通過(guò)基于圖像的解碼，可以自動(dòng)區(qū)分不同的條形碼，并利用位置信號(hào)進(jìn)行共局域化，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17A多個(gè)分析物。ZHENG等[34]建立圖形編碼的二氧化硅粒子平面襯底(25 μm×14 μm)的懸浮陣列芯片系統(tǒng)，編碼粒子薄膜涂層由高、低折射率交替介質(zhì)材料(Si3N4和SiO2)周期性多層疊加而成。利用該系統(tǒng)成功創(chuàng)建GRASP assay法，可聯(lián)合檢測(cè)Ⅰ型糖尿病患者的胰島細(xì)胞抗原谷氨酸脫羧酶(GAD65)、胰島素瘤抗原2 (IA-2)和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8 (ZnT8) 3種血清自身抗體。與臨床診斷結(jié)果比較，GRASP assay檢測(cè)靈敏度高達(dá)92.0%，特異度達(dá)100.0%。此外，產(chǎn)品化的全自動(dòng)磁條碼多重液相芯片檢測(cè)平臺(tái)(MCLIA-800)，采用多層復(fù)合材料，以“棒狀”和“點(diǎn)狀”組合制備編碼多達(dá)4 096種的芯片，實(shí)現(xiàn)單管中同時(shí)進(jìn)行17種抗核抗體的檢測(cè)，該體系具有高通量、高靈敏度、反應(yīng)速度快、隨機(jī)進(jìn)樣等特點(diǎn)。自身免疫性生物標(biāo)記物臨床診斷應(yīng)用研究尚在起步階段，隨著編碼微球、設(shè)備不斷改進(jìn)，檢測(cè)成本降低，該技術(shù)在自免診斷領(lǐng)域有望發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值。

3.3腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 腫瘤篩查一般采用影像檢查技術(shù)，該法對(duì)惡性腫瘤患者的預(yù)后評(píng)估缺乏有效的參考價(jià)值，組織病理活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)患者侵襲性極高。血清腫瘤標(biāo)志物來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞，包括酶、蛋白質(zhì)、激酶等，尤為適合人群普篩，液相懸浮陣列芯片技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物蛋白和游離核酸修飾等臨床檢測(cè)趨于流行。

XU等[35]基于反蛋白石光子晶體(PEGDA和瓊脂糖構(gòu)成)編碼微球的液相懸浮陣列芯片技術(shù)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)。PEGDA構(gòu)成的反蛋白石光子晶體能夠提供編碼信號(hào)和保證穩(wěn)定性，且該結(jié)構(gòu)空隙大利于分子的進(jìn)出；瓊脂糖提供功能基團(tuán)固定抗體，檢測(cè)限分別可達(dá)0.21 ng/mL和0.78 ng/mL。XIANG等[36]基于UiO-66-NH2金屬有機(jī)框架包裹在不同形態(tài)的微生物表面，形成用于檢測(cè)的新型微生物UiO-66-NH2復(fù)合材料而提出了的一種可識(shí)別形態(tài)的懸浮陣列。微生物賦予了復(fù)合材料不同形態(tài)和尺寸的條形碼能力，UiO-66-NH2具有穩(wěn)定的剛性外殼、較大的比表面積和具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的金屬離子，可以簡(jiǎn)化蛋白的固定化過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)結(jié)腸癌患者的miRNA-21、miRNA-17和miRNA-182核酸序列。此外，Luminex的Human Cancer Biomarkers液相懸浮芯片可對(duì)CA15-3、CA19-9、CA125、前列腺特異性抗原(PSA)等25種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行同步檢測(cè)，利用生物素-鏈霉親和素(BSA)和SA-PE熒光素實(shí)現(xiàn)微量因子的信號(hào)放大。液相懸浮陣列芯片作為腫瘤的普篩技術(shù)，不僅可大大縮減篩查檢測(cè)時(shí)間，為臨床提供輔助診斷依據(jù)，還可預(yù)判疾病發(fā)展的階段和程度，在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。

3.4其他生物活性物質(zhì)的檢測(cè) 心血管疾病作為危害人類健康的一大慢性疾病，其篩查診斷指標(biāo)眾多，液相懸浮陣列芯片技術(shù)可實(shí)現(xiàn)諸多心血管疾病生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)，如冠心病可檢測(cè)的標(biāo)志物有脂聯(lián)素/Acrp30、CD40、CD40配體等；急性心肌梗死可檢測(cè)的標(biāo)志物有心臟肌紅蛋白、cTNI等。此外，可應(yīng)用于糖尿病與代謝病生物標(biāo)志物的檢測(cè)，如胰島素、胰島素C-肽、IGFBP-1、IGFBP-3、IGFBP-rp1/IGFBP-7等。液相芯片不僅可用于臨床疾病診斷，而且也可用于信號(hào)通路臨床研究，如IFN-γ、IFN-γR1、腎素、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF、M-CSF等小分子活性物質(zhì)水平檢測(cè)。

4 展 望

液相懸浮陣列芯片技術(shù)可彌補(bǔ)傳統(tǒng)ELISA、化學(xué)發(fā)光技術(shù)的通量和組合檢測(cè)需求，具有高通量、準(zhǔn)確、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)具有廣闊臨床應(yīng)用前景的同時(shí)也存在挑戰(zhàn)。例如：(1)國(guó)內(nèi)熒光微球技術(shù)落后，具有高性能、高附加值的熒光微球材料被國(guó)外Luminex公司壟斷、占據(jù)著絕對(duì)龍頭地位；(2)血清中嗜異性抗體的存在可能干擾蛋白分析，牛血清清蛋白(BSA)作為一種阻斷劑可降低非特異性吸附克服背景信號(hào)增強(qiáng)，且不能連續(xù)監(jiān)測(cè)樣品濃度；(3)國(guó)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人才缺乏，諸多標(biāo)志物組在臨床診斷的價(jià)值有待大樣本、多中心研究。

與此同時(shí)，液相芯片技術(shù)的應(yīng)用還面臨諸多機(jī)遇：(1)與新型編碼微球技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)、抗體核酸技術(shù)等充分結(jié)合，實(shí)現(xiàn)同一個(gè)平臺(tái)多種臨床樣本分析；(2)有望在超過(guò)40個(gè)臨床診斷領(lǐng)域如基因突變研究、細(xì)胞因子、病原微生物等深入應(yīng)用研究；(3)“床旁檢測(cè)”(POCT)診斷平臺(tái)臨床需求大，開發(fā)高通量微型液相懸浮陣列芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)POCT診斷是未來(lái)的趨勢(shì)。隨著醫(yī)院接診量提高，自動(dòng)化檢驗(yàn)需求加大，多指標(biāo)聯(lián)合的高通量篩查需求不斷加大，液相懸浮陣列芯片技術(shù)多元化的發(fā)展與臨床疾病診斷的聯(lián)系越來(lái)越密切，液相芯片技術(shù)不僅可實(shí)現(xiàn)高通量、高精度、多項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，同時(shí)還減少了樣本量及檢驗(yàn)人員工作量，在臨床診斷方面有著廣闊的應(yīng)用前景。