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    野生樹舌靈芝菌株的分子鑒定

    2021-07-29 01:21:52蘭玉菲怡唐麗娜李秀梅
    食用菌 2021年4期
    關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹泰安市離心管

    蘭玉菲 孔 怡唐麗娜 李秀梅

    (泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東泰安271000)

    樹舌靈芝(Ganoderma applanatum)隸屬于靈芝屬(Ganoderma),為我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌。樹舌靈芝性平、味苦,具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抑菌消炎等多種功效,且無(wú)任何毒性,臨床多用于治療乙型肝炎、食道癌、肺結(jié)核、神經(jīng)衰弱等[1-4]。

    2009年以來(lái),筆者從山東省泰安市及其周邊地區(qū)采集野生樹舌靈芝,用組織分離法分離并純化,3次純化后獲得純培養(yǎng),并用分子生物學(xué)手段獲得ITS序列并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,明確了分類地位,為進(jìn)一步馴化栽培和育種提供遺傳背景清晰的種質(zhì)資源。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    供試菌株均由筆者從泰安市、曲阜市等采集的野生樹舌靈芝子實(shí)體分離純化所得,保存于泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食用菌研究所。

    1.2 主要試劑與儀器

    真菌總DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit)、2×EasyTaq PCR SuperMix等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。My Cycle PCR儀,美國(guó)伯樂(lè)儀器公司。

    1.3 培養(yǎng)基

    PDA加富培養(yǎng)基:配方參照文獻(xiàn)[5]。

    1.4 組織分離和培養(yǎng)

    參照《植病研究方法》[6],將采集的野生樹舌靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)點(diǎn)表面用70%酒精擦洗后,用解剖刀切取5 mm2組織塊,接入PDA加富培養(yǎng)基中,置于25℃黑暗培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)后,3次純化培養(yǎng)獲得菌絲純培養(yǎng)。

    1.5 菌絲體制備及DNA的提取

    切取PDA加富斜面培養(yǎng)基上保存的5 mm2菌株純培養(yǎng),將其接種于PDA加富平板培養(yǎng)基中央,25℃黑暗培養(yǎng)5~7 d,待菌絲長(zhǎng)至平板邊緣,刮取菌絲體(用于基因組DNA的提取)。

    利用DNA提取試劑盒提取真菌總DNA。取200 mg新鮮菌絲體,于液氮中研磨成粉末轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中,加入600μL Buffer FG1,混勻后65℃保溫10 min,其間輕柔攪動(dòng)2次;之后加入140μL Buffer FG2混勻,≥10 000g離心10 min;小心吸取上清,加入0.7倍體積的異丙醇混勻,10 000g,離心2 min;倒掉上清液并排出離心管中的殘留液體,加入300μL含有RNase的ddH2O重懸沉淀,加入150μL Buffer FG3和300μL無(wú)水乙醇混勻;將混合液加入HiBind DNA柱中,10 000g離心1 min,加700μL DNA Wash Buffer,10 000g,離心1 min,漂洗2次;將柱子移至干凈的1.5 mL離心管上,加入100μL Elution Buffer,室溫放置2~3 min,10 000g離心1 min,洗脫DNA,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 ITS擴(kuò)增

    采用真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]。PCR反應(yīng)體系(50μL):2×EasyTaqPCR SuperMix 25μL,ddH2O 22μL,模板DNA 1μL(約20 ng),正向和反向引物各1μL(0.4 nmol/L)。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,57℃退火45 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

    1.7 PCR產(chǎn)物測(cè)序

    PCR結(jié)束后,取4μL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序。

    1.8 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

    將所得DNA序列輸入GenBank進(jìn)行Blast檢索,采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5軟件對(duì)所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應(yīng)序列進(jìn)行比較和分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 野生樹舌靈芝的采集及分離純化

    采集到野生樹舌靈芝10份(表1)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)野生樹舌靈芝常生于楊、樺、柳、櫟等闊葉樹的枯立木、倒木或伐樁上,多年生,屬重要的木腐菌,導(dǎo)致木材木質(zhì)部形成白色腐朽。采用組織分離方法,并在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)3次純化后獲得純培養(yǎng)。

    表1 供試菌株來(lái)源、采集時(shí)間及編號(hào)

    2.2 野生樹舌靈芝的形態(tài)特征

    野生樹舌靈芝子實(shí)體大,無(wú)柄;菌蓋半圓形,基部常下延,有同心環(huán)紋棱及大小不等的瘤狀突起,邊緣薄或圓鈍,無(wú)油漆樣光澤(圖1);菌肉棕褐色至深褐色,有輪紋,無(wú)黑色殼質(zhì)層;菌管褐色,有白色菌絲填充,一層至多層,孔面污白色或淡灰褐色,老后褐色至深褐色,管口近圓形。孢子卵圓形,一端有截頭,壁雙層,外壁光滑,無(wú)色,內(nèi)壁有刺狀突起,褐色,大小為(6.5~9.5)μm×(5~6.5)μm(圖2)。

    圖1 部分野生樹舌靈芝

    圖2 野生樹舌靈芝孢子形態(tài)(×40)

    2.3 ITS基因的擴(kuò)增

    利用DNA提取試劑盒提取樹舌靈芝菌株的總DNA,用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,10個(gè)供試菌株均擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為600 bp的目的片段,與預(yù)期片段大小一致。

    2.4 序列測(cè)定與分析

    序列測(cè)定結(jié)果表明,樹舌靈芝ITS序列長(zhǎng)度為560 bp(GenBank登錄號(hào)分別為KM249934、KM249935、KM249936、MG657360、MG657361、MG657362、MG657363、MG657364、MG657365、MG657366),其中包括204 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)、155 bp 5.8S編碼序列、201 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)。同源性比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)10個(gè)分離物與GenBank中的3個(gè)樹舌靈芝分離物(DQ424996、DQ425009、JN008873)聚為一簇,ITS核苷酸一致率為99.46%~100%,從分子水平上證明10個(gè)分離物為G.applana?tum。

    圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

    3 小結(jié)

    泰山市及其周邊地區(qū)具有豐富的野生樹舌靈芝種質(zhì)資源,但目前尚未對(duì)其野生種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)研究,且鑒定手段多為形態(tài)學(xué)描述,尚未開展分子水平鑒定,對(duì)其遺傳背景了解甚少,嚴(yán)重影響其馴化栽培和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。筆者采集泰山市及其周邊地區(qū)野生樹舌靈芝,采用組織分離法培養(yǎng),3次純化后獲得了10個(gè)樹舌靈芝菌株的純培養(yǎng),從分子水平上證明10個(gè)分離物為G.applanatum。

    研究從分子水平上對(duì)泰山市及其周邊地區(qū)野生樹舌靈芝進(jìn)行了分離鑒定,明確了其分類地位,為育種工作提供遺傳背景清晰的野生種質(zhì)資源,同時(shí)為野生樹舌靈芝的馴化栽培和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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