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    右美托咪定抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞Parthanatos死亡

    2021-07-29 10:29:28堯永華陸殿宇
    現(xiàn)代醫(yī)院 2021年5期
    關(guān)鍵詞:復(fù)氧培養(yǎng)箱氧化應(yīng)激

    谷 宇 堯永華 陸殿宇

    急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)是一種常見的臨床并發(fā)癥,以腎小球濾過率突然下降為主要特征。近年來盡管腎臟替代療法等支持治療取得了較大進(jìn)步,AKI 發(fā)生5年后死亡率仍高達(dá)50%[1]。腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是引發(fā)AKI的主要原因,可見于許多臨床情況下,如腎移植、部分腎切除、心臟手術(shù)、敗血癥等[2]。既往多項研究指出,RIRI過程中腎小管上皮細(xì)胞主要發(fā)生凋亡和壞死,然而采取相應(yīng)的干預(yù)性治療措施并不能有效降低患者的發(fā)病率及死亡率[3]。因此,深入探討RIRI的致病機(jī)制,尋找有效的防治方法仍是臨床亟待解決的難題。

    新近研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷參與多種疾病的細(xì)胞損傷和死亡過程,尤其在缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury, IRI)相關(guān)的細(xì)胞死亡中起重要作用[4-5]。輕度細(xì)胞DNA損傷可以通過活化多聚ADP 核糖聚合酶-1(PolyADP-ribose polymerase-1, PARP-1)完全修復(fù);較嚴(yán)重DNA損傷會引發(fā)細(xì)胞凋亡;而廣泛嚴(yán)重的DNA損傷會引發(fā)一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡形式——PARP-1依賴性細(xì)胞死亡(Parthanatos)。最近有研究提示Parthanatos可能是IRI細(xì)胞死亡的重要形式。本研究旨在探討Parthanatos與RIRI病理過程之間的關(guān)系,為進(jìn)一步尋找有效藥物干預(yù)Parthanatos死亡并防治AKI打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(中國典型培養(yǎng)物保藏中心);胎牛血清,胰蛋白酶(Gibco);右美托咪定(Dexmedetomidine, Dex, 江蘇恒瑞);CCK-8檢測試劑盒(Dojindo);LDH試劑盒(Roche);活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑(Sigma-Aldrich);Trizol試劑(Invitrogen);ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和SYBR? Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及H/R處理 我們采用人腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)模型模擬RIRI。細(xì)胞培養(yǎng)箱(溫度37 ℃, 濕度90%, 95%空氣+5%CO2)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。HK-2細(xì)胞培養(yǎng)至融合約80%,進(jìn)行H/R處理,細(xì)胞更換為無糖無血清培養(yǎng)基,放入濕潤的缺氧培養(yǎng)箱(Galaxy 48R; Eppendorf, Hamburg, 德國)進(jìn)行低氧(95% N2+5% CO2)處理24 h,隨后取出放入常氧環(huán)境進(jìn)行復(fù)氧處理4 h,即缺氧24 h復(fù)氧4 h(H/R)處理。

    1.2.2 實(shí)驗分組及藥物處理 細(xì)胞用隨機(jī)數(shù)字表分為4組:對照組(Control)組、Dex組、H/R組、Dex+H/R組,每組n=5。Dex組和Dex+H/R組預(yù)先用含1 nmol/L右美托咪定的培養(yǎng)基處理1 h,隨后Dex組更換為普通培養(yǎng)基放回常氧培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),Dex+H/R組則更換為無糖無血清培養(yǎng)基放入低氧培養(yǎng)箱進(jìn)行H/R處理。

    1.2.3 細(xì)胞活力和LDH釋放檢測 將HK-2細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞密度約5 000個/孔。不同處理完成后,應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)(Cell Counting Kit-8, CCK-8)試劑盒和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒,按照試劑盒說明書進(jìn)行具體操作,使用酶標(biāo)儀檢測檢測細(xì)胞活力以及LDH釋放情況。

    1.2.4 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量 細(xì)胞接種于24孔板,各組處理完畢后,應(yīng)用2,7-二氯熒光素二乙酸脂(2,7-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

    1.2.5 實(shí)時定量PCR(qRCR) 應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen)提取細(xì)胞中總RNA,NanoDrop-1000分光光度計檢測RNA量和濃度,ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,SYBR? Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)以及Roche LightCycler 1.1行qRCR定量分析PARP-1mRNA和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis Inducing Factor, AIF)mRNA變化,使用GAPDH作為管家基因。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,組間比較使用單因素方差分析,P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    表1 實(shí)驗使用的引物序列

    2 結(jié)果

    2.1 Dex能明顯減輕H/R處理導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞損傷

    與Control組相比,H/R處理能明顯降低HK-2細(xì)胞的活力(P<0.05),而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理1 h后再行H/R處理,能明顯提升HK-2細(xì)胞的活力(P<0.05),Dex本身對HK-2細(xì)胞的活力無明顯作用。見圖1。

    注:*與對照組比較有顯著差異,P<0.05;#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05

    與Control組相比,H/R處理能明顯增加細(xì)胞LDH的釋放(P<0.05),而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理1 h后再行H/R處理,能明顯降低HK-2細(xì)胞LDH的釋放(P<0.05),Dex本身對HK-2細(xì)胞LDH的釋放無明顯作用。見圖2。

    注:*與對照組比較有顯著差異,P<0.05;#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05

    2.2 Dex能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增多

    與Control組相比,H/R處理能明顯增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量(P<0.05),而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加(P<0.05),Dex本身對HK-2細(xì)胞ROS的含量無明顯作用。見圖3。

    注:*與對照組比較有顯著差異,P<0.05;#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05

    2.3 Dex能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)PARP-1mRNA和AIF mRNA表達(dá)

    與Control組相比,H/R處理能明顯提升細(xì)胞內(nèi)PARP-1 mRNA和AIF mRNA表達(dá)(P<0.05),而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)PARP-1 mRNA和AIF mRNA表達(dá)(P<0.05),Dex本身對HK-2細(xì)胞PARP-1 mRNA和AIF mRNA表達(dá)無明顯作用。見圖4。

    注:*與對照組比較有顯著差異,P<0.05;#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05

    3 討論

    AKI的病理學(xué)特征主要是腎小管上皮細(xì)胞損傷和死亡[6]。既往研究認(rèn)為壞死和凋亡是AKI腎細(xì)胞最重要的死亡方式[7]。RIRI不同階段細(xì)胞死亡的主要形式不同,短暫腎缺血導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,而長期持續(xù)的腎缺血則造成細(xì)胞的壞死[8]。然而針對壞死和凋亡的干預(yù)治療并未有效改善RIRI患者的預(yù)后。近年來研究發(fā)現(xiàn),DNA損傷與多種疾病的細(xì)胞損傷和死亡相關(guān),尤其在器官缺血性疾病中似乎扮演著重要的角色[4-5]。

    DNA儲存著生命體賴以生存和繁衍的遺傳信息,其完整性的維系對個體生存和物種穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。然而,在生命進(jìn)程中DNA難免會受到多種外源性(如紫外線輻射和電離輻射)以及內(nèi)源性(如ROS)損傷因素的攻擊,進(jìn)而引起DNA損傷[9-11]。據(jù)報道,ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞DNA損傷的重要因素[12]。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)RIRI過程中會產(chǎn)生大量的ROS[13]。因此我們推測RIRI中發(fā)生的嚴(yán)重氧化應(yīng)激可能造成腎細(xì)胞DNA損傷,甚至直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PARP-1是一種能感應(yīng)DNA損傷的核蛋白酶。PARP-1在細(xì)胞DNA氧化損傷中具有雙向作用:促進(jìn)DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞存活以及誘導(dǎo)Parthanatos死亡。過多ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會造成持續(xù)的DNA損傷,導(dǎo)致PARP-1過度活化,消耗細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和ATP,引起能量耗竭及線粒體功能障礙,最終引發(fā)AIF介導(dǎo)的Parthanatos死亡[14]。本研究建立與動物RIRI模型相對應(yīng)的細(xì)胞H/R模型,排除了神經(jīng)體液的影響,直接探討其對細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞Parthanatos死亡的影響。研究發(fā)現(xiàn),H/R能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生,同時Parthanatos死亡關(guān)鍵基因PARP-1和AIF的表達(dá)明顯也增高,這與細(xì)胞活力的降低以及LDH釋放的增加具有明顯的同步性。提示Parthanatos死亡可能與H/R導(dǎo)致的腎細(xì)胞活力下降以及細(xì)胞死亡關(guān)系密切。

    Dex是一種高選擇性的α2腎上腺素能受體(α2-AR)激動劑,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抗交感神經(jīng)的活性,廣泛應(yīng)用于臨床麻醉及重癥醫(yī)學(xué)[15-17]。近年來,Dex在抑制氧化應(yīng)激和全身炎癥反應(yīng)、降低細(xì)胞死亡等方面的作用受到越來越多的關(guān)注[18-22]。本研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用Dex能明顯抑制H/R腎細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加,同時還顯著降低H/R腎細(xì)胞內(nèi)PARP-1和AIF的表達(dá),提示Dex可能通過減輕氧化應(yīng)激,進(jìn)而降低Parthanatos死亡的發(fā)生。這與Dex預(yù)處理可明顯增加H/R腎細(xì)胞活力、降低腎細(xì)胞LDH釋放的結(jié)果相吻合。

    綜上所述,我們認(rèn)為腎細(xì)胞缺氧復(fù)氧過程中Parthanatos死亡可能具有重要作用,而Dex可能通過抑制ROS的產(chǎn)生降低Parthanatos死亡的發(fā)生。

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