介孔硅納米顆粒負載氟尿嘧啶用于肝癌和乳腺癌治療的研究

宋洋，鐘克力

近些年，全球生態(tài)環(huán)境被不斷破壞，使得腫瘤的發(fā)病率不斷提高。腫瘤臨床研究表明，腫瘤的死亡率已成為醫(yī)學(xué)界的難題。目前，治療惡性腫瘤的主要手段是化療、手術(shù)、放療等。傳統(tǒng)化療容易使體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性，以及化療藥物本身也具有毒副作用，嚴重制約其臨床的應(yīng)用［1-4］。近年來，隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，納米載藥系統(tǒng)也應(yīng)運而生。相較于傳統(tǒng)化療，納米載藥系統(tǒng)主要將藥物包裹在納米顆粒內(nèi)部，減少藥物與正常細胞的接觸，降低了毒副作用，以及納米顆粒與生物組織的相容性也有利于腫瘤治療［5-8］。因此，設(shè)計高負載量，低毒性的納米載藥系統(tǒng)是目前腫瘤治療亟待解決的問題。

在眾多納米載藥顆粒中，介孔硅納米顆粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）因其獨特的優(yōu)勢而吸引大量科研工作者的關(guān)注［9，10］。MSN具有粒徑分布均一、水溶性良好、大孔容積等優(yōu)勢。MSN可以在孔道內(nèi)負載各種熒光材料、化療藥物、蛋白，且具有優(yōu)良的生物相容性［11-14］。因此，MSN作為優(yōu)良的納米載體，廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷、治療等納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。5-FU作為一種廣譜抗癌藥在臨床得到應(yīng)用，但是長期使用可以引起神經(jīng)毒性等副作用［15-18］，因此怎樣合理使用5-FU顯得尤為重要。在本課題中，我們利用溶膠-凝膠法合成介孔硅納米顆粒，然后負載抗腫瘤藥物5-FU（MSN@5-FU），通過各種表征手段來檢測5-FU的負載情況，最后，我們使用肝癌和乳腺癌細胞來驗證MSN@5-FU的抗腫瘤治療效果。

1 材料與方法

1.1 試劑

原硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU，上海阿拉丁試劑公司）；乙醇、三乙醇胺、鹽酸、甲醇、碳酸鈉、鹽酸（國藥試劑有限公司），高糖培養(yǎng)基（DMEM，碧云天公司）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，碧云天公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，碧云天公司）；實驗用水為超純水。

1.2 儀器

JEM-2100HR透射電子顯微鏡（日本電子JEOL公司）；UVmini-1240型紫外-可見光分光光度計（日本島津公司）；粒度儀Mastersize 2000（英國馬爾文公司）；JSM-6360型掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）；多標記微孔板檢測儀（美國Perkinelmer公司）；冷凍干燥箱（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 MSN@5-FU的制備和載藥量

稱取CTAB 2.00 g和三乙醇胺80 mg于100 mL三口燒瓶中，加入20 mL去離子水中，冷凝回流，快速磁力攪拌1 h后逐滴加入1 mL TEOS，于90℃快速磁力攪拌反應(yīng)1 h，得到介孔硅微球。將上述反應(yīng)產(chǎn)物離心洗滌1次后，加入40 mL甲醇和2 mL濃鹽酸于150 mL圓底燒瓶中，接上冷凝回流裝置，緩慢磁力攪拌于50℃進行酸醇回流除去模板劑CTAB，反應(yīng)12 h后更換酸醇回流液后繼續(xù)除模板反應(yīng)，重復(fù)3次后將產(chǎn)品進行離心洗滌3次，即得到MSN。

稱取6 mg MSN加入一定量的5-FU溶液和2 mL PBS緩慢磁力攪拌24 h后用H2O離心洗滌6次，即得到MSN@5-FU，將全部洗滌液收集后進行紫外分光光度計檢測265 nm處吸光度值，并通過標準曲線計算出溶液中5-FU的濃度，通過前后計算出MSN@5-FU的載藥量和包封率。

1.4 MSN@5-FU的體外釋放實驗

將5 mg MSN@5-FU分別加入pH 7.4和pH 5.0的PBS 4 mL，置于37℃恒溫搖床中以120 r/min的速率持續(xù)振搖，在攪拌0、2、4、6、8、12、24和36 h 10000 r/min離心5 min取出上清液1 mL后再加入1 mL PBS繼續(xù)振搖。并將取出的液體進行紫外分光光度計檢測在265 nm處吸光度值，并計算溶液中5-FU濃度。

1.5 腫瘤細胞培養(yǎng)

將4T1（乳腺癌細胞）和HepG2（肝癌細胞）細胞在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（37℃，5%CO2），每兩天更換一次培養(yǎng)基，腫瘤細胞通過消化作用進行傳代培養(yǎng)。

1.6 RAW 264.7細胞培養(yǎng)

RAW 264.7細胞在含10%的新生小牛血清及100 IU/mL青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設(shè)定為5%CO2，37℃，隔天換液，每日觀察細胞的生長狀況。待RAW264.7細胞生長至70%～80%融合度時，棄去舊的細胞培養(yǎng)液，并用PBS洗滌細胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶，棄去消化液，立即加入含10%血清的細胞培養(yǎng)液終止消化，調(diào)整細胞至合適密度后接種于新的培養(yǎng)皿中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 細胞存活率實驗

將兩種腫瘤細胞在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入剛配制的含有MSN@5-FU納米粒子的懸液，粒子中5-FU濃度分別0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0μg/mL，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入20μL MTT（5 mg/mL），37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸出上清液后每孔加入0.5 mL PBS洗滌后每孔加入1 mL DMSO，輕輕振搖5 min，用多標記微孔板檢測儀在570 nm處測量溶液的吸光度值。MSN的細胞存活率實驗類似于上述實驗過程。

2 結(jié)果

2.1 MSN電鏡表征

如圖1所示，從透射電鏡圖中可以看出，制備的MSN分布大量的介孔孔道，且孔道均勻分布，孔徑大小相近，可以作為載藥的納米載體。此外，從掃描電鏡圖中可以看出，制備的MSN大小均一，近似球形，結(jié)構(gòu)規(guī)整，粒徑分布在120 nm左右。

圖1 透射電鏡圖（A）標尺=50 nm，掃描電鏡圖（B）標尺=200 nm

2.2 MSN@5-FU粒度儀表征

我們利用粒度儀分別表征載藥前后，納米顆粒粒徑變化情況。如圖2a所示，載藥前后MSN和MSN@5-FU的水合動力學(xué)直徑?jīng)]有明顯變化，大小在135 nm左右，這個結(jié)果和前面的電鏡結(jié)果相匹配。此外，我們還分析了MSN和MSN@5-FU在穩(wěn)定性，利用粒度儀檢測15天內(nèi)，二者的粒徑變化情況。從圖2b中可以看出，MSN和MSN@5-FU在15天內(nèi)，粒徑大小沒有發(fā)生明顯變化，說明制備的材料是優(yōu)良的納米載藥載體。

圖2 MSN和MSN@5-FU粒度儀表征

2.3 MSN@5-FU載藥量和包封率

實驗分別從載藥時間和投料比兩個方面來研究MSN@5-FU的載藥量和包封率。如圖3所示，最佳的載藥時間為24 h，當MSN：5-FU=2：1時，其載藥量13.6%，包封率為32.3%。上述結(jié)果說明MSN@5-FU具有良好的載藥能力。

圖3 不同時間與投料比下的MSN負載5-FU的載藥量與包封率

2.4 體外5-FU累積釋放實驗

實驗利用pH=7.4和pH=5.0兩種PBS分別模擬體內(nèi)生理環(huán)境和腫瘤微酸環(huán)境。實驗結(jié)果如圖4所示，MSN@5-FU在pH=5.0的PBS條件下，其累計釋放量最高可以達到72%，而在pH=7.4的PBS條件下，其最高值不到40%，上述結(jié)果說明MSN@5-FU在腫瘤微環(huán)境中有利于5-FU的釋放。此外，在pH=5.0 PBS條件下，MSN@5-FU在12 h后釋放量才達到平臺期，而在pH=7.4條件下，4 h左右就達到了一個平臺期。結(jié)果表明，在腫瘤微環(huán)境下，有利于MSN@5-FU實現(xiàn)緩釋。

圖4 不同p H MSN@5-FU的體外釋放動力學(xué)曲線

2.5 MSN體外細胞毒性實驗

材料應(yīng)用到細胞實驗中，需要考慮其對正常細胞的毒性［19］。實驗采用MTT法檢測不同濃度MSN對RAW 264.7細胞的毒性。實驗中MSN的濃度區(qū)間為0～200μg/mL。實驗結(jié)果從圖5中可以看出，在MSN濃度為50μg/mL時，MSN處理的RAW 264.7細胞，其細胞存活率接近100%，幾乎沒有凋亡。隨著濃度的不斷增加，細胞存活率也沒有明顯下降。MSN濃度達到200μg/mL時，細胞存活率仍在90%以上。上述結(jié)果表明MSN對正常細胞幾乎沒有毒性，對正常細胞的影響可以忽略不計，是一種優(yōu)良的納米載藥載體。

圖5 不同濃度MSN的細胞毒性結(jié)果

2.6 腫瘤細胞抑制增長實驗

實驗采用乳腺癌細胞（4T1）和肝癌細胞（HepG2）進行MSN@5-FU抗腫瘤實驗。利用MTT法考察不同濃度的MSN@5-FU對兩種腫瘤細胞的增長抑制情況。如圖6所示，在5-FU濃度為3μg/mL時，MSN@5-FU對兩種腫瘤細胞的抑制率分別為18.2%（4T1）和16.6%（HepG2）。此外，從圖中可以看出，在5-FU濃度為0.5μg/mL時，MSN@5-FU對4T1和HepG2同樣具有一定的抑制作用，隨著濃度的不斷增加，抑制效果越來越明顯。上述結(jié)果說明MSN@5-FU對兩種腫瘤細胞都有優(yōu)良的抑制增殖能力，具有一定的普適性，并且具備進行活體實驗的潛力。

圖6 4T1細胞（a）和Hep G2細胞（b）的細胞存活率結(jié)果

3 討論

本實驗設(shè)計了MSN負載5-FU的納米載藥系統(tǒng)用于肝癌和乳腺癌的抗腫瘤實驗。首先合成了納米級的MSN材料，通過電鏡照片，可以發(fā)現(xiàn)材料形貌規(guī)整，粒徑大小分布均一，孔徑分布清晰，孔道完整，并且其制備方法簡單，原料便宜，適宜進行大批量生產(chǎn)。合成的MSN@5-FU可以穩(wěn)定存在，并且MSN：5-FU=2：1時，其載藥量13.6%，包封率為32.3%。在腫瘤微環(huán)境的pH下，可以大量釋放5-FU，并且可以達到緩釋的效果。研究發(fā)現(xiàn)，MSN@5-FU具有優(yōu)秀的生物相容性，對正常細胞的毒性可以忽略不計。最后，使用兩種腫瘤細胞來評估MSN@5-FU的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的抗腫瘤能力，未來具有解決化療藥物耐藥性的潛力。