多孔四氧化三鐵靶向遞送尼日利亞菌素誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡聯(lián)合光熱療法用于三陰型乳腺癌治療的研究

江偉，潘越，姚和瑞*，胡海*

乳腺癌在臨床上根據(jù)雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（Her-2）的表達(dá)水平可將乳腺癌分為Luminal型、HER-2過表達(dá)型及三陰型3種分子亞型［1，2］。三陰型乳腺癌（TNBC）則因其惡行程度高、療效差、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)預(yù)后最差［3-5］。相比其它類型乳腺癌，TNBC對(duì)靶向Her-2的靶向治療和內(nèi)分泌治療不敏感，而對(duì)化療比較敏感，但盡管如此，化療的響應(yīng)人群有限，預(yù)后仍然不理想。盡管對(duì)于有BRCA突變的患者可以應(yīng)用PARP抑制劑，但80%以上的TNBC沒有BRCA突變。因此尋找一種新型、低毒、高效的治療策略，對(duì)TNBC的治療有著重大意義。

Fe3O4是一種磁性納米材料，又名磁鐵礦，是唯一一種被FDA批準(zhǔn)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的金屬氧化物［6］。Fe3O4已被廣泛應(yīng)用于藥物靶向遞送、磁共振成像（MRI）造影劑、熱療、DNA或蛋白質(zhì)分離、生物傳感等方向［7-11］。納米載體藥物遞送技術(shù)正在不斷成熟，納米載藥遞送技術(shù)的成熟為腫瘤的精準(zhǔn)靶向治療提供了可能。而Fe3O4則是靶向性、穩(wěn)定性良好的藥物載體，但目前國內(nèi)外暫無Fe3O4負(fù)載焦亡誘導(dǎo)藥物（尼日利亞菌素）的相關(guān)研究報(bào)道。在我們的研究中合成形貌均一，穩(wěn)定性好，光熱轉(zhuǎn)化性能好的Fe3O4是研究的關(guān)鍵。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）作為一種新型的細(xì)胞程序性死亡方式，細(xì)胞焦亡的現(xiàn)象最早在上世紀(jì)90年代由Zychlinsky等［12］在感染志賀菌的小鼠的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，自從被發(fā)現(xiàn)以來一直備受關(guān)注。細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制可分為依賴于Caspase-1的經(jīng)典途徑和依賴于Caspase-4/5/11的非經(jīng)典途徑［13，14］。Caspase的活化一方面可作用于Gasdermin蛋白，切割該蛋白產(chǎn)生帶C端結(jié)構(gòu)域和帶N端結(jié)構(gòu)域的兩段蛋白，帶N端結(jié)構(gòu)域的蛋白最終可與細(xì)胞膜結(jié)合并導(dǎo)致細(xì)胞膜的穿孔，細(xì)胞內(nèi)容物釋出［15，16］?；罨腃aspase另一方面可促進(jìn)IL-1β和IL-18前體的成熟，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18，隨細(xì)胞內(nèi)容物一起釋放到胞外，并引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)［13，17］。細(xì)胞焦亡已被證實(shí)與慢性炎癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、艾滋病、腫瘤等多種疾病相關(guān)［18-22］。本研究中通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡的方式來治療腫瘤可能是將來腫瘤治療領(lǐng)域的一種潛在的治療手段。

尼日利亞菌素（nigericin，nig）可以在巨噬細(xì)胞中引起細(xì)胞焦亡［23］，是一種焦亡誘導(dǎo)藥物。但沒有相關(guān)的研究證明在腫瘤細(xì)胞中也能同樣誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞焦亡，然而nigericin卻被證明有抗腫瘤的效果。Liu等［24］證實(shí)了nigericin可以通過抑制大腸癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來達(dá)到抑制腫瘤的生長、遷移和侵襲的效果。Hegazy等［25］表示nigericin有抑制癌癥干細(xì)胞的特性，可誘導(dǎo)mTORC1失活和AMPK磷酸化對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生明顯的治療效果。本研究將從焦亡的角度來探索nigericin和腫瘤的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1購于ATCC細(xì)胞庫。Fe3O4納米粒子（合成），尼日利亞菌素-Nigericin（InvivoGen公司）。

1.1.2 儀器 水熱釜（上海新諾儀器集團(tuán)有限公司），電動(dòng)攪拌器（常州方科儀器有限公司），磁力攪拌器（德國IKA艾卡公司），高分辨透射電鏡（美國FEI公司），q-PCR儀（羅氏公司），酶標(biāo)儀（TECAN，瑞士帝肯）。

1.1.3 試劑 CCK-8試劑盒（APExBIO公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司），南美特級(jí)胎牛血清FBS（Biological Industries），雙抗——青霉素、鏈霉素（New Cell&Molecular Biotech），胰酶（GIBCO公司），PBS緩沖液（GIBCO公司），兔抗鼠N-GSDMD單抗（Abcam公司），HRP標(biāo)記的抗兔IgG單抗（Cell SignalingTechnology公司），ECL超敏發(fā)光液（ABPBiosciences公司），RNA快速提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司），5×PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa公司），SYBR Premix Ex TaqⅡ2×（TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4納米粒子的制備 FeCl3·6H2O（1.08 g，4 mmol）、檸檬酸鈉（C6H5O7Na3·2H2O）（2.35 g，8 mmol）和尿素（0.72 g，12 mmol）緩慢的溶解到80 ml的蒸餾水中，攪拌混合均勻后，然后再加入聚丙烯酰胺（0.6 g）（在攪拌的過程中緩慢加入），用磁力攪拌器劇烈的攪拌1 h。得到的混合溶液轉(zhuǎn)移到不銹鋼高壓釜中，并在200℃保溫12 h。用乙醇和去離子水的混合溶液將產(chǎn)物洗滌三次，洗滌后常溫真空干燥，得到固體產(chǎn)物，該產(chǎn)物不會(huì)團(tuán)聚，能很好地再次溶于水溶液中，置于干燥器中保存。

1.2.2 Fe3O4納米粒子的物理表征 透射電鏡拍攝：將Fe3O4納米粒子加入純水中，超聲分散5 min使其在水中充分分散均勻，取1滴溶液滴在透射電鏡的銅網(wǎng)上，室溫靜置10 min，并放置恒溫烘箱中烘干，水分烘干后放置透射電鏡下觀察Fe3O4納米粒子的形態(tài)。

1.2.3 Fe3O4納米粒子負(fù)載nigericin 稱取10 mg Fe3O4于5 mL EP管A，加入2.5 mL DMSO，高功率超聲5 min至完全分散，稱取50 mg nigericin于另一5 mL EP管B，稱取5 mg多巴胺（PD）于另一5 mLEP管C中。

將溶解有Fe3O4的DMSO加入EP管B中，高功率超聲5 min至完全分散，并將混合溶液轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中，在超聲振蕩下，往離心管中逐滴滴入20 mL Tris-HCl緩沖液（10 mM，pH=8.8），使溶液處于堿性環(huán)境，繼續(xù)超聲5 min。

往管C中加入2.5 mL純水溶解多巴胺，加入上述50 mL離心管中將溶液混合均勻，使用攪拌器攪拌3 h，可見溶液顏色變成黑色，得到負(fù)載完成后的Fe3O4@nigericin混合溶液。負(fù)載完成后將溶液進(jìn)行分裝成10等份，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4 Fe3O4納米粒子的光熱性能驗(yàn)證 配制不同濃度0μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL的Fe3O4溶液，連接好808 nm激光（NIR）發(fā)射器，連接好光熱成像儀，將激光器功率調(diào)節(jié)至1 W/cm2，對(duì)準(zhǔn)Fe3O4溶液上方進(jìn)行激光照射10 min，利用光熱成像儀進(jìn)行拍攝記錄溫度。

1.2.5 Fe3O4納米粒子的生物相容性測(cè)定 將培養(yǎng)的4T1細(xì)胞消化下來種于96孔板，使每孔細(xì)胞數(shù)量為1000個(gè)，共設(shè)置6組，每組4～5個(gè)復(fù)孔，96孔板孔內(nèi)細(xì)胞長至50%后，棄去上清，6組分別加入終濃度含0μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL的Fe3O4溶液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入CCK8工作液，孵育2 h后，用酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測(cè)OD值。

1.2.6 細(xì)胞殺傷能力測(cè)定 將培養(yǎng)的4T1細(xì)胞消化下來種于96孔板，使每孔細(xì)胞數(shù)量為1000個(gè)，共設(shè)置6組，每組3個(gè)復(fù)孔，96孔板孔內(nèi)細(xì)胞長至50%后，棄去上清，6組分別加入完全培養(yǎng)基，終濃度分別含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液，200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液（12 h時(shí)予以808 nm激光照射10 min）。培養(yǎng)至12 h時(shí)，第6組進(jìn)行80 nm激光照射，每孔10 min，并繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，再加入CCK8工作液，孵育2 h后，用酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測(cè)OD值。

1.2.7 細(xì)胞焦亡驗(yàn)證

1.2.7.1 GSDMD蛋白western-blot 將培養(yǎng)的4T1細(xì)胞消化下來種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，共設(shè)置6組，6組分別加入完全培養(yǎng)基，終濃度分別含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液，200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液（12 h時(shí)予以808 nm激光照射10 min）。培養(yǎng)至12 h時(shí)，第6組進(jìn)行808 nm激光照射10 min，并繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，用ripa裂解液裂解細(xì)胞收取蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，加入loading buffer煮沸10 min使蛋白變性，根據(jù)所測(cè)濃度等蛋白質(zhì)量上樣，進(jìn)行電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后使用5%的牛奶進(jìn)行封閉1 h，TBST洗干凈牛奶后進(jìn)行一抗孵育4度過夜，次日再用TBST清洗3遍，使用二抗孵育1h，再用TBST清洗3遍，進(jìn)行ECL發(fā)光。

1.2.7.2 IL-1β、IL-18基因q-PCR 將培養(yǎng)的4T1細(xì)胞消化下來種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，共設(shè)置6組，6組分別加入完全培養(yǎng)基，終濃度分別含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液，200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液（12 h時(shí)予以808 nm激光照射10 min）。培養(yǎng)至12 h時(shí)，第6組進(jìn)行808 nm激光照射10 min，并繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，使用RNA快速提取試劑盒提取RNA，所得RNA進(jìn)行測(cè)濃度，并根據(jù)濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所得c-DNA使用引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過2-ΔΔct法計(jì)算各組的相對(duì)表達(dá)量。各引物序列為actin-F：CTCTCCCTCACGCCATC；actin-R：ACGCACGATTTCCCTCTC；IL-18-F：AAAGTTAGGTGGGGAGGGT；IL-18-R：CAGCCTCGGGTATTCTGTT；IL-1β-F：TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG；IL-1β-R：AGGTCCACGGGAAAGACACAGG。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用IBM SPSSStatistics 25.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的形式表示，通過單因素方差分析對(duì)多組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，進(jìn)而使用LSD方法比較兩兩比較。當(dāng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fe3O4納米粒子的物理表征

利用FeCl3·6H2O、檸檬酸鈉和尿素合成的Fe3O4納米顆粒，通過透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察到的結(jié)果為圖1a和b，顯示其納米顆粒整體外觀形態(tài)規(guī)則、呈現(xiàn)為球形，大小一致、分散均勻、無團(tuán)聚現(xiàn)象，通過比例尺測(cè)量其粒徑約為240～250 nm，納米顆粒的內(nèi)部有光線透過，表示其為內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)。在觀察Fe3O4納米顆粒具有良好的形貌后，我們將其與nigericin混合負(fù)載，并在其外表面包裹一層鹽酸多巴胺，完成后再次拍攝透射電鏡，觀察到的結(jié)果為圖1c和d，可以看出負(fù)載藥物后Fe3O4納米粒子的形態(tài)未發(fā)生變化，外觀仍然呈現(xiàn)球形，并在其外表面形成了一層膜包裹住了納米顆粒，通過比例尺測(cè)量其粒徑約為310～320 nm。

圖1 A：Fe3O4的TEM圖；B：Fe3O4的TEM圖（放大后）；C：負(fù)載后Fe3O4的TEM圖；D：負(fù)載后Fe3O4的TEM圖（放大后）

2.2 Fe3O4納米粒子的光熱實(shí)驗(yàn)

納米材料的光熱轉(zhuǎn)化性能決定著光熱療法的效果，因此對(duì)合成的Fe3O4納米顆粒進(jìn)行光熱性能測(cè)定，將Fe3O4納米顆粒溶解于純水中，配制不同濃度25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的Fe3O4溶液，在808 nm激光器下照射10 min，并記錄溫度變化，圖2的結(jié)果顯示，808 nm的激光照射可以很好地使Fe3O4溶液升溫，200μg/mL的Fe3O4溶液4 min左右即可使溶液升至40℃以上，其升溫效率呈濃度和時(shí)間依賴性，具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能。

圖2 不同濃度Fe3O4溶液808 nm激光照射升溫曲線

2.3 Fe3O4納米粒子的生物相容性

納米材料的毒性往往限制了納米材料的生物應(yīng)用，良好的生物相容性是其在生物體中應(yīng)用的前提。測(cè)定合成的Fe3O4納米顆粒的生物相容性，將Fe3O4納米顆粒溶解于純水中，配制不同終濃度25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的Fe3O4溶液，并將不同濃度的Fe3O4溶液加入至培養(yǎng)好的4T1細(xì)胞中，共培養(yǎng)24 h，測(cè)定細(xì)胞的存活率。圖3的結(jié)果顯示，盡管隨著Fe3O4溶液濃度的增加，細(xì)胞的存活率略有降低，但最高濃度200μg/mL的Fe3O4溶液與細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞的存活率仍然接近90%以上，可認(rèn)為其對(duì)細(xì)胞的毒性很小。

圖3 不同濃度Fe3O4溶液對(duì)4T1細(xì)胞存活率影響

2.4 細(xì)胞殺傷能力測(cè)定

在驗(yàn)證了Fe3O4納米顆粒的良好的生物相容性和光熱轉(zhuǎn)化性能后，我們將其應(yīng)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，我們配制了對(duì)應(yīng)的不同終濃度的負(fù)載藥物后的Fe3O4@nigericin溶液，與4T1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，并對(duì)其進(jìn)行808 nm激光照射，測(cè)定細(xì)胞的存活率（圖4a），并計(jì)算了其對(duì)細(xì)胞的抑制率（圖4b）。結(jié)果顯示與圖3結(jié)果對(duì)比，細(xì)胞存活率明顯下降，證實(shí)了nigericin聯(lián)合光熱療法對(duì)4T1細(xì)胞有很好的殺傷效果（P＜0.001）。

2.5 GSDMD蛋白western-blot

在證實(shí)nigericin聯(lián)合光熱療法具有很好的細(xì)胞殺傷性能后，我們通過western-blot來驗(yàn)證細(xì)胞在被殺傷過程中是否發(fā)生了焦亡。我們?cè)谂囵B(yǎng)的6組細(xì)胞中分別加入完全培養(yǎng)基、終濃度分別含5μg/mLnigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin（12 h時(shí)予以808 nm激光照射10 min），24 h后收取蛋白樣品進(jìn)行western-blot實(shí)驗(yàn)，孵育兔抗鼠N-GSDMD單抗。圖5的結(jié)果顯示在加入nigericin和進(jìn)行了光熱治療后，N-GSDMD的表達(dá)量明顯增加，細(xì)胞焦亡得到了增強(qiáng)，在蛋白水平證實(shí)了細(xì)胞焦亡在細(xì)胞殺傷中發(fā)揮了重要作用。

圖4 A：不同濃度Fe3O4負(fù)載藥物后聯(lián)合808 nm激光對(duì)4T1細(xì)胞存活率影響；B：不同濃度Fe3O4負(fù)載藥物后聯(lián)合808 nm激光對(duì)4T1細(xì)胞的抑制率。

2.6 IL-1β、IL-18基因q-PCR

除了蛋白水平的驗(yàn)證，我們還驗(yàn)證了焦亡細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18的基因水平的變化，在培養(yǎng)的6組細(xì)胞中分別加入完全培養(yǎng)基、終濃度含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin（12 h時(shí)予以808 nm激光照射10 min），24 h后收取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行q-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，圖6的結(jié)果顯示對(duì)比NC組，在加入nigericin和進(jìn)行了光熱治療后，IL-1β、IL-18基因的表達(dá)都有相應(yīng)的增加（P＜0.01），此結(jié)果與蛋白表達(dá)水平的趨勢(shì)大基本一致。

3 討論

圖5 A：不同處理因素作用細(xì)胞后GSDMD蛋白的表達(dá)水平；B：western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果灰度分析柱狀圖

圖6 A：不同處理因素作用細(xì)胞后IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量；B：不同處理因素作用細(xì)胞后IL-18基因的相對(duì)表達(dá)量

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率正逐年升高，發(fā)病人群也在逐漸年輕化，其中三陰型乳腺癌多發(fā)生于絕經(jīng)前女性，其在所有乳腺癌中占15%左右［26，27］，多為中晚期乳腺癌（Ⅲ-Ⅳ），且死亡率高，在Afshin Rakhsha的研究中報(bào)道，TNBC的Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者5年總生存率分別為92.3%、86.5%、57.8%和9%［28］。因此鑒于傳統(tǒng)療法對(duì)TNBC的療效差的現(xiàn)狀，尋找一種新型、高效、低毒的療法是提高TNBC生存率的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明Fe3O4負(fù)載nigericin聯(lián)合光熱療法對(duì)小鼠三陰型乳腺癌4T1細(xì)胞具有明顯的殺傷作用。

納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有了多方面的應(yīng)用，但往往納米材料的生物相容性制約了其的進(jìn)一步應(yīng)用。納米材料的毒性機(jī)制仍未十分清楚［29］，但生物相容性差的納米材料會(huì)損傷體內(nèi)的正常組織及細(xì)胞。Chu［30］等人的研究發(fā)現(xiàn)二氧化硅納米顆?？梢酝ㄟ^非特異性內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞中被膜包被的細(xì)胞器中，從而影響細(xì)胞器的功能而產(chǎn)生毒性。Annangi［31］等人研究了氧化鋅對(duì)野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的毒性影響，發(fā)現(xiàn)僅僅1μg/mL氧化鋅即可在細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，進(jìn)而損傷細(xì)胞的DNA。Hu［32］等人研究了氧化石墨烯納米片對(duì)A549細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米片可以直接與細(xì)胞膜相互作用對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生物理損傷。我們的研究結(jié)果顯示，在Fe3O4濃度高達(dá)200μg/mL時(shí)細(xì)胞的存活率仍然接近90%，因此可認(rèn)為合成的Fe3O4在不高于200μg/mL的濃度內(nèi)細(xì)胞毒性很低，具備良好的生物相容性。

已有研究報(bào)道Fe3O4具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能，可用作光熱治療的光熱轉(zhuǎn)化劑。在Lu［33］等的Fe3O4/Au DSNFs多模態(tài)成像指導(dǎo)的乳腺癌治療的研究中，他們所設(shè)計(jì)的Fe3O4/Au DSNFs比游離的USIONPs有著更高的光熱轉(zhuǎn)換效率（82.7%）。Ge等［34］人的研究表明Fe3O4-R837 SP可以通過PTT激活體內(nèi)先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)來顯著增強(qiáng)PD-L1的全身治療效率。Yuan等［35］人在Fe3O4的表面包裹一層PEG分子形成了PEG-Fe3O4復(fù)合物，通過激光照射可明顯抑制C6細(xì)胞的活力，表明了其優(yōu)秀的光熱抗癌功效。本研究的結(jié)果顯示我們合成的Fe3O4具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能，與相關(guān)的文獻(xiàn)的報(bào)道一致。

目前已有一系列最新研究揭示了焦亡和免疫與腫瘤有著密不可分的關(guān)系。邵峰院士團(tuán)隊(duì)［36］的另一重大發(fā)現(xiàn)揭示了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞在發(fā)揮其作用殺傷靶細(xì)胞的過程中產(chǎn)生的Granzyme A可以裂解激活GSDMB，導(dǎo)致靶細(xì)胞焦亡，該免疫機(jī)制可以促進(jìn)小鼠中CTL介導(dǎo)的腫瘤清除。Zhang等［37］的研究表明GSDME的表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤浸潤性自然殺傷細(xì)胞和CD8+T的功能和增加其數(shù)量，該分子機(jī)制可能與腫瘤抑制相關(guān)。本研究的結(jié)果證實(shí)了我們的聯(lián)合治療模式是通過細(xì)胞焦亡的機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。然而本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在機(jī)體內(nèi)是否同樣有較好的療效以及是否能通過釋放某種炎癥因子激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，有待進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

綜上所述，F(xiàn)e3O4負(fù)載nigericin聯(lián)合光熱療法可以誘導(dǎo)小鼠三陰型乳腺癌4T1細(xì)胞發(fā)生焦亡以達(dá)到治療TNBC的目的。本研究的相關(guān)結(jié)果能為該方向的研究提供重要的參考價(jià)值，對(duì)改善TNBC治療的現(xiàn)狀提高TNBC的生存率具有重要的意義。