云南省牛流行性出血病血清學(xué)調(diào)查

寇美玲，謝佳芮，楊振興，苗海生

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

流行性出血熱（epizootic hemorrhagic disease，EHD）是由流行性出血熱病毒（epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）引起的，通過庫蠓傳播的非接觸性蟲媒病毒病，主要引起鹿（尤其是白尾鹿）體溫升高，黏膜和漿膜面廣泛出血，甚至休克致死，也可引起牛發(fā)病[1]，主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)。2013—2018 年，山西、內(nèi)蒙古、廣東、廣西等地區(qū)均有檢測到EHDV 陽性血清的報(bào)道[2-5]。EHD 目前尚無有效的疫苗和治療方法，其暴發(fā)流行會(huì)給畜牧業(yè)帶來巨大損失[6-7]。為了解云南省EHD 流行情況及病毒血清型分布情況，2019 年在多個(gè)縣（市）采集牛血清樣品進(jìn)行EHDV 檢測，以期為我國EHD 的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 待檢樣品

在云南省5 個(gè)地州11 個(gè)縣市（芒市、瑞麗、景洪、勐臘、富寧、沾益、西盟、江城、滄源、鎮(zhèn)康、耿馬）采集牛血清樣品。每個(gè)縣市先按采樣點(diǎn)所屬地理位置劃定采樣區(qū)域，再將區(qū)域內(nèi)的養(yǎng)殖場、活畜交易市場和散養(yǎng)戶分別編號，然后根據(jù)場戶數(shù)量，隨機(jī)抽取養(yǎng)殖場1～6 個(gè)、活畜交易市場個(gè)1～2個(gè)、散養(yǎng)戶3～29 個(gè)進(jìn)行樣品采集。樣品采集地優(yōu)先選擇年均降雨量多、年均日照時(shí)間長、相對濕度大、適于媒介昆蟲庫蠓生長繁殖的熱帶、亞熱帶地區(qū)。具體樣品采集工作由當(dāng)?shù)乜h級動(dòng)物疫病控制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)，共采集1 199 份牛血清樣品（表1）。

表1 2019 年云南省11 個(gè)縣市采樣信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果 單位：個(gè)/份

1.2 病毒

EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10 型 參 考病毒，由澳大利亞麥克阿瑟?伊麗莎白農(nóng)業(yè)研究所（Elizabeth Macarthur Agricultural Institute，EMAI）提供。

1.3 C-ELISA 抗體檢測

按照EHDV C-ELISA 試劑盒說明書，對待檢血清進(jìn)行檢測。取40 μL 稀釋液加入EHDV 抗原包被的ELISA 板中，分別取10 μL 被檢血清樣品、陽性對照、弱陽性對照和陰性對照血清，加入到相應(yīng)檢測孔和對照孔中，用振蕩器震蕩或輕拍微量反應(yīng)板；將反應(yīng)板中的液體充分混勻，37 ℃溫箱溫育30 min；取出板，每孔加入50 μL 1/100 稀釋的競爭抗體，充分混勻，37 ℃溫箱溫育30 min；取出板，倒掉孔中液體，在吸水紙上拍干；每孔加入50 μL 1/100 稀釋的羊抗豚鼠HPR 酶標(biāo)二抗，充分混勻，37 ℃溫箱里溫育30 min；取出板，洗板5～6 次拍干，加入TMB 顯色液50 μL/孔，37 ℃避光溫育10 min；最后加入終止液50 μL/孔，用ELISA 讀板儀450 nm 波長測定樣本和對照的吸光值OD450

[8]。試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：兩個(gè)陽性對照孔OD450≤0.20，兩孔間OD450差值＜0.05，兩個(gè)陰性對照孔OD450≥1.00 且＜1.60，兩孔間OD450差值＜0.20。判定標(biāo)準(zhǔn)：按照抑制率（PI）=（陰性對照OD450平均值-樣品血清OD450）/陰性對照OD450平均值×100%。抑制率≥50%判為抗體陽性，否則為陰性。

1.4 血清型鑒定

從各地C-ELISA 檢出的陽性樣品中，隨機(jī)抽取18～50 份，利用EHDV 標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行微量血清中和試驗(yàn)（SNT），同時(shí)參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18636—2017[9]，按Karber 方法計(jì)算EHDV 7 個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株的半數(shù)感染量（TCID50），以確定陽性血清樣品的血清型。

1.5 檢測結(jié)果分析

采用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)各地EHDV 抗體陽性率，分析各地EHDV 主要流行毒株血清型。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清抗體檢測

應(yīng) 用EHDV C-ELISA 試 劑 盒，對 云 南 省11 個(gè)縣市1 199 份牛血清樣品進(jìn)行抗體檢測，檢出EHDV 抗體陽性血清981 份，抗體陽性率為81.8%，各縣市均檢測到抗體陽性血清，表明牛EHDV 感染在云南省普遍存在且較嚴(yán)重。各地EHDV 抗體陽性率有所差異，其中芒市最高，陽性率達(dá)91.3%，耿馬縣最低，抗體陽性率僅為49.3%。具體檢測結(jié)果見表2。

表2 2019 年云南省牛EHDV 血清抗體檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 場群分布

對抗體檢測結(jié)果進(jìn)行場群分布統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場陽性率較高，其次是活畜交易市場，散養(yǎng)戶最低，但不同采樣場群抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表3。

表3 不同采樣場群的抗體陽性樣品分布

2.3 血清型鑒定

從每個(gè)縣市的血清檢測陽性樣品中，隨機(jī)挑選18～50 份與EHDV 7 個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行SNT 檢 測。結(jié)果（表4）顯 示：EHDV-7、-10、-6、-5 血清型檢出率較高，依次為25.2%、23.2%、22.2%、15.4%，EHDV-8、-2 血清型檢出率較低，依次為6.3%、1.8%，僅在勐臘縣檢測到EHDV-2 型，未檢出EHDV-1 型；各縣市普遍存在3 個(gè)及以上的EHDV 血清型，其中勐臘縣、江城縣最多（6 個(gè)血清型），其次是芒市、瑞麗市、景洪市、富寧縣、沾益縣、滄源縣、鎮(zhèn)康縣（4 個(gè)血清型），而西盟縣、耿馬縣較少（3 個(gè)血清型）。

表4 血清檢測陽性樣品中7 個(gè)血清型的中和抗體鑒定結(jié)果

3 討論

本研究所調(diào)查的云南省11 個(gè)縣市均位于熱帶或者亞熱帶地區(qū)，年均氣溫較高，降雨量較多，年均日照時(shí)間也較長，適于各類庫蠓生長和繁殖，因而有利于EHDV 傳播，說明其流行具有地域性；采集血清的牛均未注射過EHDV 疫苗，因而血清陽性率可以反映出牛的自然感染情況；對牛血清樣品進(jìn)行EHDV C-ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)，除耿馬縣（49.3%）外，其余縣市抗體水平均較高，陽性率均在69.6%以上，說明EHDV 在云南省流行廣泛且較為嚴(yán)重。不同采樣場群的血清樣品EHDV 抗體陽性率差異不顯著（P＞0.05），說明云南省不同場點(diǎn)的EHDV 流行態(tài)勢相似，這可能與云南省不同場點(diǎn)的環(huán)境特征、傳播媒介類似有關(guān)[10]。

本研究調(diào)查了EHDV 的7 個(gè)血清型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各縣市均存在3 個(gè)及以上血清型的流行，其中勐臘、江城2 個(gè)縣血清型最多，有6 個(gè)血清型。EHDV 的流行與傳播媒介庫蠓的種類和移動(dòng)轉(zhuǎn)播有關(guān)，從而引起新血清型傳入，導(dǎo)致多種血清型同時(shí)存在[10]。在血清型鑒定中發(fā)現(xiàn)，富寧縣、西盟縣、鎮(zhèn)康縣等地均存在同一份陽性血清樣品檢出至少2 種血清型情況，說明云南省存在多種血清型病毒的混合流行。EHDV 血清型之間無交叉保護(hù)[11]，這給EHD 防治帶來了困難。血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，部分血清檢測陽性樣品未檢出上述7 個(gè)血清型，說明云南省可能存在7 個(gè)血清類型以外的其他血清型，也進(jìn)一步說明云南省流行的EHDV 血清型更加復(fù)雜，具體需要進(jìn)一步研究。

盡管我國未見牛和鹿發(fā)生EHD 臨床病例的報(bào)道，但對牛有較強(qiáng)致病力的EHDV-2、-6、-7 型毒株均分離到[12-13]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省11 個(gè)縣市中，EHDV-6、-7 血清型陽性數(shù)量較多，說明云南省有發(fā)生該病的風(fēng)險(xiǎn)，需要引起動(dòng)物防疫部門和養(yǎng)殖戶的重視。1959 年首次在日本茨城發(fā)現(xiàn)EHDV-2 型毒株導(dǎo)致牛發(fā)病，病死率達(dá)10.3%，將之命名為茨城病[14]。此次在勐臘縣也檢測到EHDV-2 型，提示應(yīng)加強(qiáng)對該地區(qū)的持續(xù)監(jiān)測。

通過對云南省11 個(gè)具有地域代表性縣市的牛血清進(jìn)行檢測和鑒定，發(fā)現(xiàn)各地均存在EHDV 多種血清型流行，且抗體陽性率普遍較高，這需要引起疫病控制機(jī)構(gòu)和養(yǎng)殖人員的足夠重視。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，EHDV 在云南省流行廣泛且較嚴(yán)重，流行血清型復(fù)雜，需持續(xù)開展血清學(xué)監(jiān)測，加強(qiáng)該病防控。