花椰菜AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員BobERF17響應(yīng)逆境脅迫的表達(dá)及功能研究

李 慧 楊亞苓 李 聰 李麗紅 韓占品 王春國(guó)

(1天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

花椰菜(Brassica oleraceaL.var.botrytis L.)又名花菜、菜花，原產(chǎn)于地中海沿岸，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，花球是其主要食用部分?；ㄒ嘶ㄇ蛑胁粌H含有維生素C 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還富含抗癌、防癌活性成分蘿卜硫素。蘿卜硫素被認(rèn)為是蔬菜作物中抗癌活性最強(qiáng)的天然成分之一[1]。因此，花椰菜作為一種保健類蔬菜深受廣大消費(fèi)者的喜愛，自19 世紀(jì)傳入我國(guó)以來，種植面積逐漸增大[2－3]。目前，我國(guó)已成為全球花椰菜種植面積最大、總產(chǎn)量最高的國(guó)家。但花椰菜遺傳背景狹窄，我國(guó)育種資源匱乏，使得采用傳統(tǒng)雜交育種方式培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)花椰菜新品種遇到巨大挑戰(zhàn)[4－6]。此外，花椰菜基礎(chǔ)研究仍十分薄弱，人們對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)的分子基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)還很有限，限制了基因工程手段在花椰菜種質(zhì)創(chuàng)制及品種培育中的應(yīng)用。

APETALA2/乙烯響應(yīng)因子(APETALA2/ethyleneresponsive factor，AP2/ERF)是廣泛存在于植物中的一類轉(zhuǎn)錄因子超家族。目前在番茄[7]、蘋果等[8]等多種植物中的ERF 轉(zhuǎn)錄因子已被成功克隆。研究證實(shí)，該家族成員均含有一段由60～70 個(gè)氨基酸組成的AP2保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)含有AP2 結(jié)構(gòu)域的數(shù)目不同，AP2/ERF 超家族可進(jìn)一步分為AP2、ERF、RAV 及Soloist 四個(gè)家族，其中AP2 家族成員含有2 個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域，ERF 家族成員含有1 個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守氨基酸序列的不同，ERF 家族又可進(jìn)一步分為ERF 和DREB 兩個(gè)亞家族。RAV 家族除具有1 個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域外，還含有1 個(gè)B3 結(jié)構(gòu)域，而Soloist成員僅含有1 個(gè)AP2-like 結(jié)構(gòu)域[9－10]。研究表明AP2家族成員主要在植物花器官發(fā)育、種子大小發(fā)育等調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11－14]。而ERF 家族成員被證實(shí)主要在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。如在水稻(Oryza sativaL.)中過表達(dá)OsERF71 可顯著影響水稻根系結(jié)構(gòu)，提高轉(zhuǎn)化株對(duì)干旱的耐受[15]。在煙草中過表達(dá)麻瘋樹(Jatropha curcasL.)JcERF1 可以顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽脅迫的耐受[16]。三葉枳(Poncirus trifoliataL.Raf.)PtrERF109 通過直接調(diào)控Prx1 在增強(qiáng)植株耐寒性方面發(fā)揮作用[17]。84K 楊樹中ERF38 的過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)鹽脅迫的耐受性[18]。青花菜(Brassica oleraceaL.var.italic)BrERF2 響應(yīng)酸雨脅迫[19]，番茄(Solanum lycopersicum)SLERF83、SLERF84和SLERF109 可能在響應(yīng)生物及非生物脅迫中均有作用[7，20]，在擬南芥(Arabidopsis thanliana)中過表達(dá)SLERF84 可以顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)干旱及鹽脅迫的耐受[20]。本研究前期對(duì)花椰菜在不同脅迫處理?xiàng)l件下基因差異表達(dá)譜特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)大量ERF 轉(zhuǎn)錄因子在受到干旱或鹽脅迫下呈現(xiàn)差異表達(dá)[21]，但這些轉(zhuǎn)錄因子在花椰菜應(yīng)答逆境脅迫中的功能仍需進(jìn)一步研究。為此，本研究對(duì)其中一個(gè)干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)ERF 家族成員BobERF17 進(jìn)行克隆并進(jìn)一步對(duì)其序列、表達(dá)特征及功能進(jìn)行探究，旨在揭示ERF轉(zhuǎn)錄因子在花椰菜逆境響應(yīng)中的功能，為開展花椰菜抗逆分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花椰菜供試種子津品70 由天津科潤(rùn)蔬菜研究所孫德嶺研究員惠贈(zèng)；擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)種子，大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株LBA4404、植物表達(dá)載體pCAMBIA3301 由南開大學(xué)染色體實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 花椰菜幼苗不同逆境脅迫處理

花椰菜種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，待幼苗長(zhǎng)出2～3 片真葉時(shí)，分組進(jìn)行不同脅迫處理，每個(gè)脅迫處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。干旱及鹽脅迫參照Li 等[21]的方法。干旱脅迫時(shí)，將花椰菜幼苗根部浸在20% 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG 6000)溶液中，分別在0、2、4、8 和12 h 取材。鹽脅迫處理時(shí)，將花椰菜幼苗根部浸在200 mmol·L－1NaCl 溶液中，分別在0、4、8、12、24 h取材。前期試驗(yàn)表明，花椰菜幼苗期的適宜生長(zhǎng)溫度約為15～25℃，可耐受38～40℃的高溫和－5～0℃的低溫，但溫度高于40℃或低于－5℃可使幼苗在短時(shí)間內(nèi)就呈現(xiàn)出明顯的溫度脅迫癥狀。為此，高溫脅迫時(shí)，將花椰菜幼苗置于光照培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為45℃，光照強(qiáng)度為5 000 Lux，分別于0、4、8、12、24 h 取材；低溫脅迫時(shí)，將花椰菜幼苗置于－15℃冰箱中，分別于0、30、60、90、120 min 取材。

1.3 花椰菜DNA 提取

以花椰菜幼嫩真葉為材料，采用CTAB 裂解法[22]提取花椰菜基因組DNA。75%乙醇洗滌DNA 沉淀，無菌水溶解后除去RNA 污染，使用NanoDrop－1000(Thermo Fisher，美國(guó))測(cè)定DNA 濃度。

1.4 花椰菜RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

按照RNA 提取試劑盒(寶生物，大連)操作說明書提取花椰菜總RNA。測(cè)定RNA 的濃度及用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，質(zhì)量檢測(cè)合格的RNA 置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA 按照M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega)說明書反轉(zhuǎn)合成cDNA 第一鏈。

1.5 花椰菜不同脅迫處理?xiàng)l件下BobERF17 表達(dá)特征的qRT-PCR 分析

根據(jù)BobERF17 編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(real-time quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)引物:BobERF17-S:5′GAAGGACGAG GAGATGATGC3′；BobERF17-A:5′ATAATCCCTTGTA GGTGAAAGCT3′，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，βactin為內(nèi)參，采用iQ5 PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)進(jìn)行qRT-PCR 分析。每個(gè)脅迫處理分別設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)，BobERF17 相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCT法計(jì)算。

1.6 BobERF17 植物過表達(dá)載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的BobERF17 擴(kuò)增引物:NcoIBobERF17-S:5′CCATGGATGGAGGAGGAAGGGTCGT3′；BstE Ⅱ-BobERF17-A:5′GGTCACTCAAAAATTCCAAA GATGCA 3′。以花椰菜cDNA 為模板，采用反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 方法對(duì)BobERF17 進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA 克隆。對(duì)含有BobERF17 的TA 陽(yáng)性質(zhì)粒及pCAMBIA3301 表達(dá)載體進(jìn)行NcoⅠ和BstE Ⅱ雙酶切，膠回收酶切后的BobERF17 片段及pCAMBIA3301，二者采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)序正確后提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化株鑒定

將上述構(gòu)建好的BobERF17 重組過表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲T0 代種子，經(jīng)春化后將T0 代種子種于營(yíng)養(yǎng)土中，待幼苗長(zhǎng)至2 片真葉時(shí)，噴灑除草劑(10% Basta 稀釋10 000 倍)進(jìn)行抗性篩選。將篩選獲得的抗性株系進(jìn)行進(jìn)一步的分子鑒定，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行自交純合，T3 代后的純合轉(zhuǎn)化株系用于后續(xù)分析。

1.8 過表達(dá)BobERF17 擬南芥株系的表型分析

過表達(dá)BobERF17 擬南芥T3 代陽(yáng)性苗和野生型種子同時(shí)播種于滅菌營(yíng)養(yǎng)土中，并置于相同生長(zhǎng)條件，觀察分析兩者的表型差異。選取生長(zhǎng)4 周的過表達(dá)BobERF17 擬南芥株系進(jìn)行干旱、鹽、高/低溫脅迫處理，觀察其表型，并進(jìn)一步采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析其存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BobERF17 編碼區(qū)cDNA 的克隆及序列分析

以花椰菜葉片cDNA 為模板，采用RT-PCR 法對(duì)BobERF17 編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示BobERF17 編碼區(qū)長(zhǎng)度為576 bp，預(yù)期編碼一個(gè)含有191 個(gè)氨基酸的蛋白，其與之前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的序列大小一致。進(jìn)一步序列分析顯示，BobERF17 含有一個(gè)保守的AP2 結(jié)構(gòu)域，其與雙子葉植物，特別是與花椰菜同屬的蕓薹屬植物如油菜、白菜等中的ERF17 具有較高的序列相似性，而與水稻、玉米、高粱等單子葉植物中的ERF17 相似性較低(圖1-A、B)。結(jié)果表明，BobERF17 與油菜、白菜等雙子葉植物中的ERF17 在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系，推測(cè)它們可能具有相似的功能，而與單子植物中ERF17 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 不同植物中ERF17 聚類樹(A)及氨基酸序列比對(duì)(B)分析Fig.1 Phylogenetic tree (A) and sequence alignment (B) of ERF17 from diverse plants

2.2 BobERF17 在不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)特征

采用qRT-PCR 法對(duì)BobERF17 在不同逆境脅迫處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在干旱脅迫條件下，BobERF17 表達(dá)量呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)，在干旱處理8 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量有所下降，但仍比未處理前高(圖2-A)。與干旱脅迫處理下的表達(dá)特征相似，在45℃高溫脅迫處理?xiàng)l件下，BobERF17 表達(dá)量呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)，處理4 h 時(shí)表達(dá)量到達(dá)峰值，處理24 h 后植株已嚴(yán)重萎蔫，瀕臨死亡，表達(dá)量低于處理之前(圖2-B)。與高溫脅迫相比，低溫脅迫并未顯著誘導(dǎo)BobERF17 的表達(dá)(圖2-C)。在鹽脅迫條件下，除處理12 h 外BobERF17 的表達(dá)與對(duì)照(0 h)相比未呈現(xiàn)顯著升高或降低的表達(dá)趨勢(shì)(圖2-D)。上述結(jié)果表明，BobERF17 正向響應(yīng)干旱及高溫脅迫，而對(duì)鹽及低溫脅迫不敏感，暗示BobERF17 在花椰菜干旱及高溫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

圖2 花椰菜不同脅迫處理下BobERF17 表達(dá)特征分析Fig.2 Expression profiles of BobERF17 under different abiotic stresses

2.3 過表達(dá)BobERF17 擬南芥株系篩選及分子鑒定

根據(jù)載體及BobERF17 序列設(shè)計(jì)組合引物(35SS:5′AACAGAACTCGCCGTAAAG3′，cauliflower-ERF17-A:5′CCGAACCAACAGTCGGAAGC3′)及檢測(cè)BobERF17表達(dá)的qRT-PCR 引物(BobERF17at-S:5′CGATGATGA TGAGGACGATG3′； BobERF17at-A:5′AAAATTCCAAA GATGCACCG3′)，分別采用PCR 及qRT-PCR 對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。以轉(zhuǎn)化株DNA 為模板，利用組合引物進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果顯示，在隨機(jī)挑取的6 個(gè)轉(zhuǎn)化株中均可以檢測(cè)到預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，證明含有BobERF17 的表達(dá)載體已成功整合到擬南芥基因組中(圖3-A)。以轉(zhuǎn)化株RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，利用上述BobERF17at-S/A 引物進(jìn)行qRT-PCR 分析。結(jié)果證實(shí)，BobERF17 在擬南芥轉(zhuǎn)化株中呈現(xiàn)高表達(dá)(圖3-B)。上述結(jié)果表明，BobERF17 已成功轉(zhuǎn)入擬南芥，并且在轉(zhuǎn)化株中呈現(xiàn)高表達(dá)。

圖3 BobERF17 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性株的分子鑒定Fig.3 Identification of overexpressed BobERF17 transgenic lines in Arabidopsis

2.4 過表達(dá)BobERF17 擬南芥株系干旱脅迫分析

對(duì)過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行自交，獲得純合的T3 代株系。將生長(zhǎng)4 周的過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系及野生型對(duì)照，在一次性澆足水后不再澆水進(jìn)行干旱脅迫處理。結(jié)果表明，在干旱處理4 d 左右BobERF17 過表達(dá)擬南芥株系與野生型的生長(zhǎng)表型開始出現(xiàn)差異，轉(zhuǎn)基因植株整體生長(zhǎng)情況優(yōu)于對(duì)照(圖4-A)。隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，在干旱處理12 d 后，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)未受明顯影響，而野生型對(duì)照葉片呈現(xiàn)泛黃、萎蔫等干旱脅迫癥狀。當(dāng)干旱脅迫處理24 d，野生型對(duì)照葉片明顯萎縮，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系盡管葉片也表現(xiàn)出一定程度的萎縮，但植株整體生長(zhǎng)勢(shì)顯著強(qiáng)于對(duì)照(圖4-A)。經(jīng)干旱24 d 后對(duì)所有植株進(jìn)行復(fù)水并統(tǒng)計(jì)其存活率，結(jié)果顯示過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的存活率顯著高于野生型對(duì)照(圖4-B)。上述結(jié)果表明，在擬南芥中過表達(dá)BobERF17 可顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)干旱的脅迫耐受。

圖4 干旱脅迫下過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系表型(A)及存活率(B)分析Fig.4 Phenotypes (A) and survival rate (B) of overexpressed BobERF17 transgenic Arabidopsis under drought stress

2.5 過表達(dá)BobERF17 擬南芥株系高溫脅迫分析

為進(jìn)一步探究BobERF17 在高溫脅迫應(yīng)答中的功能，對(duì)生長(zhǎng)4 周的過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系及野生型對(duì)照置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行45℃高溫處理，并對(duì)其在處理0、12、24 h 及正常溫度(22℃)恢復(fù)生長(zhǎng)2 d 后的表型進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，在高溫處理12 h 后，過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照葉片均表現(xiàn)出一定程度的卷曲、皺縮，二者差異不明顯。但在處理24 h 后，野生型擬南芥表現(xiàn)為葉片嚴(yán)重干枯及皺縮現(xiàn)象，而BobERF17 過表達(dá)轉(zhuǎn)化株系葉片雖然也呈現(xiàn)進(jìn)一步的皺縮，但皺縮程度低于野生型對(duì)照(圖5-A)。并且在將所有植株恢復(fù)至正常溫度生長(zhǎng)后，過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系呈現(xiàn)較高的存活率而對(duì)照組大部分已死亡，無法繼續(xù)生長(zhǎng)(圖5-B)。結(jié)果表明，在擬南芥中過表達(dá)BobERF17 不但可以顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)干旱脅迫的耐受，也可以提高其對(duì)高溫脅迫的耐受。

圖5 高溫脅迫下過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系表型(A)及存活率(B)分析Fig.5 Phenotypes (A) and survival rate (B) of overexpressed BobERF17 transgenic Arabidopsis under high temperature stress

2.6 過表達(dá)BobERF17 擬南芥株系鹽及低溫脅迫分析

為進(jìn)一步探究BobERF17 在鹽及低溫脅迫中的功能，分別對(duì)過表達(dá)BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系及野生型對(duì)照采用200 mmol·L－1的NaCl 和－15℃進(jìn)行鹽和低溫脅迫處理。在鹽脅迫處理25 d 后恢復(fù)正常澆水，并統(tǒng)計(jì)后期植株存活率。結(jié)果表明，過表達(dá)BobERF17并未顯著提高轉(zhuǎn)化株在鹽脅迫下的存活率(圖6－A)。與之相似，在低溫處理90 min 后將所有株系重新置于22℃的正常生長(zhǎng)溫度，并統(tǒng)計(jì)其后期存活率。結(jié)果表明，BobERF17 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型對(duì)照呈現(xiàn)相似的低溫凍害表型特征，二者存活率無顯著差異(圖6－B)。上述結(jié)果表明，在擬南芥中過表達(dá)BobERF17 并未顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽及低溫的耐受水平。

圖6 鹽(A)及低溫(B)脅迫處理下BobERF17過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系存活率統(tǒng)計(jì)分析Fig.6 Survival rate of overexpressed BobERF17 transgenic Arabidopsis under salt (A) and low temperature (B) stresses

3 討論

在長(zhǎng)期的自然選擇下，植物體內(nèi)形成了復(fù)雜的應(yīng)對(duì)逆境脅迫的防御體系[23－24]。一些ERF 家族成員恰好處在植物防御相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的交叉點(diǎn)，其通過對(duì)下游靶基因的調(diào)控發(fā)揮在植物逆境脅迫響應(yīng)的作用。但ERF 家族成員在植物響應(yīng)不同逆境脅迫中的功能不盡相同。本研究結(jié)果表明，花椰菜BobERF17與蕓薹屬植物中的ERF17 序列具有較高同源性，而與單子葉植物的ERF17 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，暗示BobERF17與蕓薹屬其他植物中的ERF17 可能具有相似的功能。但目前有關(guān)蕓薹屬植物中ERF17 的報(bào)道較少。因此，對(duì)蕓薹屬不同植物中ERF17 進(jìn)行克隆并探究其在響應(yīng)逆境脅迫中的作用，對(duì)于深入揭示ERF17 在蕓薹屬植物中的分子進(jìn)化特征及功能具有重要意義。已有研究表明，香蕉中ERF17 參與干旱及冷應(yīng)激調(diào)控[25]。在一氧化氮處理下，落葉松(Larix olgensis)LoERF017對(duì)鹽、干旱及ABA 等脅迫均有應(yīng)答，在擬南芥中過表達(dá)LoERF017 可以顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)干旱及鹽脅迫的耐受[26]。與前人研究結(jié)果一致，BobERF17 在干旱脅迫條件呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，并且在擬南芥中過表達(dá)BobERF17 也可顯著提高轉(zhuǎn)化株的耐旱性，表明ERF17 轉(zhuǎn)錄因子在不同植物響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用。此外，本研究結(jié)果證實(shí)BobERF17除正向響應(yīng)干旱脅迫外，其對(duì)高溫脅迫也十分敏感，高溫脅迫可以誘導(dǎo)BobERF17 的表達(dá)，過表達(dá)BobERF17轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高溫的耐受性顯著提高，但BobERF17對(duì)鹽及低溫脅迫不敏感，推測(cè)其可能是在BobERF17基因啟動(dòng)子區(qū)不具有鹽及低溫脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白或調(diào)控因子的順式作用元件，使之無法感知鹽及低溫脅迫。并且近幾年的一些報(bào)道表明，植物中ERF17 不但參與逆境脅迫應(yīng)答，還被證實(shí)在柑橘果實(shí)風(fēng)味調(diào)控[27]、蘋果葉綠素的積累[28]等過程中發(fā)揮重要作用。上述結(jié)果表明，包括BobERF17 在內(nèi)的植物ERF17 在進(jìn)化過程中發(fā)生了亞功能化，可能具有多重生物學(xué)功能，值得進(jìn)一步深入探究其功能及調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究對(duì)花椰菜BobERF17 進(jìn)行了克隆、表達(dá)及功能探究。結(jié)果表明，BobERF17 與雙子葉植物，特別是蕓薹屬植物中的ERF17 序列具有較高相似性，但與單子葉植物中該轉(zhuǎn)錄因子序列差異很大。BobERF17在干旱及高溫脅迫條件下均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)特征，但對(duì)鹽及低溫脅迫響應(yīng)不敏感。在擬南芥中過表達(dá)BobERF17 對(duì)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育無明顯影響，但可以顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)干旱及高溫脅迫的耐受。