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    實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法快速診斷結(jié)核病的效果

    2021-07-28 10:12:40陳澤城
    當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2021年15期
    關(guān)鍵詞:染色法涂片病原體

    李 喬,吳 健,陳澤城

    (高州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 高州 525200)

    防治結(jié)核病是全球面臨的公共衛(wèi)生問題。大量的研究表明,盡早地對結(jié)核病患者的病情進(jìn)行診治是控制其病情發(fā)展的關(guān)鍵[1-3]。目前,臨床上常采用直接涂片染色法、改良羅氏培養(yǎng)法、MGIT-960 培養(yǎng)法等對結(jié)核病患者的病情進(jìn)行診斷。本文主要是探討用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法快速診斷結(jié)核病的效果。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    本文的研究對象是2016 年6 月至2020 年6 月期間高州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科收到的526 份分泌物標(biāo)本。在這526份分泌物標(biāo)本中,痰液標(biāo)本有427 份,支氣管沖洗液標(biāo)本有37 份,尿液標(biāo)本有25 份,胸腹液標(biāo)本有25 份,膿液標(biāo)本有5 份,腦脊液標(biāo)本有2 份,心包液標(biāo)本有2 份,組織標(biāo)本有2 份,精液標(biāo)本有1 份。

    1.2 方法

    采用直接涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的方法是:按照《痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》的要求,將分泌物標(biāo)本均勻地涂抹在載玻片上,并進(jìn)行抗酸染色操作[4]。染色完畢后,將載玻片放置于顯微鏡下進(jìn)行檢查。采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的方法是:將5 ~10 mL 的分泌物標(biāo)本放置在50 mL 離心管中。按照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》及BACTEC MAGIT-960 操作規(guī)程進(jìn)行堿消化濃縮操作[5]。在沉渣中加入0.7 ~1 mL 的PBS緩沖液(pH=6.8),制成混合液。對該混合液進(jìn)行離心處理,制成離心沉渣懸浮液。將0.1 mL 的離心沉渣懸浮液加入到DNA 提取管中,將0.5 mL 的離心沉渣懸浮液加入到BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)管中,取0.1 mL 離心沉渣懸浮液制成規(guī)格為10 mm×10 mm 的載玻片,然后,按照結(jié)核分歧桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑說明書的要求,將DNA 提取管、BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)管及載玻片分別放置在達(dá)安760 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(生產(chǎn)企業(yè)為中山大學(xué)達(dá)安公司)中。按照中國防癆協(xié)會制定的《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》,對陽性菌株進(jìn)行菌種鑒定[6]。根據(jù)《痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》的要求,對采用直接涂片染色法、濃縮涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果進(jìn)行判定。按照結(jié)核分歧桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑說明書的要求,對采用Real-time PCR技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果進(jìn)行判定。根據(jù)BACTEC MGIT-960 全自動分歧桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)出具的陽性報(bào)告,對陽性菌株進(jìn)行菌種鑒定。

    1.3 觀察指標(biāo)

    觀察采用BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法、直接涂片染色法、Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對這526份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的時(shí)間、結(jié)核分枝桿菌的檢出率及用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+ 假陽性例數(shù))×100%。準(zhǔn)確率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用百分比(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 采用不同的方法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的情況

    與采用直接涂片染色法相比,采用MGIT-960 培養(yǎng)法、Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測時(shí)結(jié)核分枝桿菌的檢出率更高,P<0.05。與采用MGIT-960 培養(yǎng)法相比,采用直接涂片染色法、Realtime PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的時(shí)間更短,P<0.05。詳見表1。

    表1 采用不同的方法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的情況

    2.2 采用Real-timePCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率

    采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果顯示,真陽性患者有140 例,真陰性患者349 有例,假陽性患者有21 例,假陰性患者有16 例。采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率分別為89.7%、94.3%、93.0%。詳見表2。

    表2 采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率(%)

    3 討論

    目前,臨床上常采用直接涂片染色法、BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法等對結(jié)核病患者的分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測。采用直接涂片染色法對結(jié)核病患者的分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測具有簡便快捷、檢查費(fèi)用低的特點(diǎn)。但用此法對結(jié)核病患者病情進(jìn)行診斷的敏感度、特異度均較低。在臨床上,采用BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明,采用BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法對結(jié)核病患者病情進(jìn)行診斷的效率較低,患者需要等待1 ~2 個(gè)月才能夠得到檢查的結(jié)果[7]。近年來,分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于結(jié)核病的快速診斷中[8]。Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)基于TaqMan 熒光探針原理,可通過檢測熒光信號的強(qiáng)弱計(jì)算PCR 產(chǎn)物的數(shù)量。濃縮涂片染色法具有可直接觀察到抗酸桿菌的特點(diǎn)。陳昕昶等[9]的研究表明,采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對結(jié)核病患者的分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測,既可簡化檢驗(yàn)的流程,又可大大地縮短進(jìn)行檢測的時(shí)間。

    綜上所述,用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法可快速對結(jié)核病患者的病情進(jìn)行診斷,且準(zhǔn)確率較高。

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