Th17/Treg失衡與毛細支氣管炎發(fā)病關(guān)系研究

徐家新，李 娟，王 磊，丁周志，周 瑞

毛細支氣管炎是嬰幼兒時期常見的下呼吸道感染性疾病，可由多種病毒感染引起，如呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、腺病毒等[1]，未來可能發(fā)展為支氣管哮喘。其中僅最常見的RSV感染就可造成每年3 310萬次急性發(fā)病、320萬次住院治療和11.82萬例患兒死亡[2]，且缺乏有效的特異性治療措施，危害極大。毛細支氣管炎發(fā)病機制至今未明[3]，目前研究最多的是免疫學(xué)發(fā)病機制，其中Th17/Treg失衡參與哮喘的發(fā)病，但是否參與關(guān)于毛細支氣管炎的研究相對較少。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是免疫抑制T細胞，可分泌白細胞介素(IL)-10和IL-35等免疫抑制因子，對多種免疫細胞發(fā)揮抑制作用。輔助T淋巴細胞(Th17)是T淋巴細胞亞群的一種，屬于促炎細胞，能夠分泌IL-17等發(fā)揮作用，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Th17可能參與毛細支氣管炎的發(fā)病機制和免疫過程[4]。本研究通過檢測毛細支氣管炎患兒體內(nèi)Th17、Treg以及相關(guān)細胞因子的水平，探討Th17/Treg及細胞因子在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床病情預(yù)判和治療尋找靶點提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我科2019年10月至2020年2月收治的毛細支氣管炎患兒83例，其中男58例，女25例，年齡3.43(1.97,6.27)個月。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《兒科學(xué)》人民衛(wèi)生出版社第9版和《諸福棠實用兒科學(xué)》第8版：(1)年齡在2歲以下；(2)以喘息和肺部哮鳴音為臨床特征；(3)胸部X線檢查可見不同程度的肺充氣過度或斑片狀浸潤影，或者支氣管周圍炎及肺紋理增粗。排除標(biāo)準(zhǔn)：患慢性肺疾病(支氣管肺發(fā)育不良)、先天性呼吸道發(fā)育異常、先天性心臟病、入院前4周應(yīng)用丙種球蛋白和激素史、免疫功能缺陷和神經(jīng)肌肉疾病等。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：BYYFY-2020KY017)，并告知患兒監(jiān)護人研究相關(guān)情況，簽署相關(guān)知情同意書。

病例組分組：患兒病情嚴(yán)重程度分組標(biāo)準(zhǔn)參照毛細支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識(2014年版)[5]。病例組分為輕癥組(42例)、中癥組(21例)和重癥組(20例)。統(tǒng)計其年齡、性別、住院時間、出生方式、喂養(yǎng)方式、是否早產(chǎn)。同期健康體檢兒童30名為對照組，其中男22名，女8名，年齡(4.38±2.84)個月。2組年齡、性別具有可比性。

1.2 試劑與儀器 HumanTh17/Treg Phenotyping Kit，IgG1-APC(APC標(biāo)記的鼠抗人同型對照IgG1)，IgG1-PE(PE標(biāo)記的鼠抗人同型對照IgG1)，溶血素、Foxp3固定/破膜劑、刺激劑/蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑、RPMI1640培養(yǎng)液采購自美國BD公司。檢測儀器FACS Canto流式細胞儀(美國BD公司)。IL-6、IL-10、IL-17和IL-35試劑采購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。血常規(guī)檢測儀器希森美康XT-4000i。C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測儀器自動生化分析儀COBAS8000。降鈣素原(PCT)檢測儀器免疫定量分析儀QMT8000，肝素結(jié)合蛋白(HBP)檢測儀器Jetistar 3000。

1.3 方法 2組均于清晨采集空腹外周血靜脈血3 mL行血常規(guī)、Treg、Th17、IL-6、IL-10、IL-17和IL-35檢測，病例組另外采集外周血3 mL檢測CRP、PCT、HBP。

流式細胞檢測：抽取所有研究對象外周血各500 μL于試管中，用于流式細胞檢測Th17、Treg細胞。

剩余外周血離心，分離血漿，-80 ℃保存，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，以所測標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的吸光度值代入方程，計算出IL-6、IL-10、IL-17和IL-35的水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析、LSD檢驗。偏態(tài)分布計量資料以M(P25,P75)描述，采用Kruskal-Wallis檢驗和Mann-WhitneyU檢驗及Pearman相關(guān)分析和logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 對照組和病例組一般資料及相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果的比較 病例組各組Th17、Th17/Treg、IL-6、IL-17較對照組升高，而Treg、IL-6、IL-10較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);性別、年齡、白細胞計數(shù)、中性粒胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、嗜酸細胞計數(shù)、CRP、PCT、HBP各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1～2)。

表1 對照組和病例組之間一般資料比較[M(P25,P75)]

2.2 病例組間各組相關(guān)指標(biāo)比較 重癥組Th17、Th17/Treg、IL-6、IL-17較中癥組和輕癥組均增高，Treg、IL-10、IL-35較輕癥組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中癥組和輕癥組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CRP、PCT、HBP、住院時間、早產(chǎn)率、剖宮產(chǎn)率、喂養(yǎng)方式各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2～3)。

表2 對照組和病例組之間各項實驗指標(biāo)比較[M(P25,P75)]

2.3 病例組Th17、Treg和細胞因子間Pearson相關(guān)分析 病例組Th17與Th17/Treg、IL-17、IL-6呈正相關(guān)，與IL-35呈負相關(guān)；Treg與IL-10、IL-35呈正相關(guān)，與Th17/Treg負相關(guān);Th17/Treg與IL-17、IL-6之間呈正相關(guān)，與IL-10、IL-35負相關(guān)；IL-17與IL-6呈正相關(guān)，與IL-35呈負相關(guān)(P<0.05～P<0.01)(見表4)。

表4 Th17、Treg及相關(guān)細胞因子之間相關(guān)性分析

2.4 重癥毛細支氣管炎的危險因素分析 以重癥、非重癥為因變量，Th17/Treg、IL-17、IL-6、IL-10、IL-35為自變量，進行l(wèi)ogistic回歸分析,結(jié)果顯示Th17/Treg、IL-17和IL-6是毛細支氣管炎的重癥危險因素(P<0.05～P<0.01)(見表5)。

表5 重癥毛細支氣管炎危險因素logistic回歸分析

3 討論

毛細支氣管炎是以喘息、吸氣性三凹征、肺部可聞及哮鳴音和細濕啰音為主要臨床特征的急性下呼吸道感染疾病，在6月齡以下的嬰兒中具有較高病死率，病理生理以中性粒細胞快速浸潤、黏液分泌過多和CD8+T細胞反應(yīng)延遲為特征，其中RSV感染最為常見。有研究[6]發(fā)現(xiàn)人RSV毛細支氣管炎患兒發(fā)展為哮喘的概率約為正?；純旱?倍。關(guān)于毛細支氣管炎的具體發(fā)病機制尚不完全清楚，但存在多種免疫異常反應(yīng)，且與哮喘的發(fā)病有著相似的免疫學(xué)機制，其中Th17/Treg失衡被認為可能是其主要發(fā)病機制。

表3 病例組間臨床資料和實驗指標(biāo)比較[M(P25,P75)]

Th17和Treg細胞均是輔助T細胞家族中的成員，Th17主要起到促炎的作用，而Treg是抑制免疫的調(diào)節(jié)細胞，它們在分化上相互拮抗，功能上相互對立，Th17/Treg的平衡對機體的免疫穩(wěn)態(tài)起到重要的作用。Th17細胞能分泌多種細胞因子如IL-17、IL-6、IL-22等參與炎癥反應(yīng)，其中最主要的效應(yīng)因子是IL-17，通過誘導(dǎo)其他炎性細胞因子的表達來調(diào)節(jié)炎癥細胞的局部浸潤，從而引起組織損傷。在動物實驗中[7]，有學(xué)者在RSV感染的小鼠肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)IL-17明顯增高，并引起氣道內(nèi)黏液分泌增加。IL-17通過直接上調(diào)人氣管和支氣管上皮細胞株中黏液基因MUC5B的轉(zhuǎn)錄而促進黏液的產(chǎn)生。Th17在CD8+T淋巴細胞上與IL-17RA結(jié)合，從而導(dǎo)致IL-17的產(chǎn)生，削弱了它們降低病毒載量和減少肺部感染細胞數(shù)量的能力。中和抗IL-17抗體可減少黏液分泌和IL-13的產(chǎn)生并增加病毒清除的能力，進一步支持了過量IL-17在促進病理中的作用[8]。袁林等[9]對比了健康兒童和毛細支氣管炎患兒體內(nèi)細胞因子的變化，結(jié)果顯示毛細支氣管炎患兒血清IL-17較對照組增高，研究說明Th17和IL-17的促炎作用在毛細支氣管炎的發(fā)病和疾病發(fā)展中起著重要的作用。而IL-6在Th17的分化調(diào)控中起著重要的作用。感染促使機體分泌大量IL-6，與TGF-β協(xié)同激活Th17分化的關(guān)鍵因子維甲酸類孤核受體γt(RORγt)，誘導(dǎo)Th17增殖[10]。過度分化的Th17繼續(xù)分泌IL-6和IL-17，使得機體免疫進一步失衡，加劇炎癥反應(yīng)。在本研究的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，毛細支氣管炎患兒Th17比例、IL-6和IL-17較對照組增高，重癥組較輕癥組增高，與以上研究結(jié)果大致相同，并且三者之間相互呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，說明毛細支氣管炎患兒體內(nèi)Th17及其細胞因子明顯增高，抑制病毒清除和加劇炎癥，重癥病例更加明顯。

Treg細胞不僅抑制過度增生和病理性T細胞反應(yīng)，而且限制Th2型免疫反應(yīng)，并對新生小鼠的病毒增殖起抑制作用[11]。因此，Treg細胞不僅能在RSV感染期間驅(qū)動適當(dāng)?shù)目共《痉磻?yīng)，而且能抑制疾病的發(fā)展。在缺乏Treg的小鼠體內(nèi)形成的過度炎癥環(huán)境可直接導(dǎo)致T效應(yīng)細胞異?；罨⑵錃w巢到呼吸道外的多種組織部位，從而延長病程[12]。Tregs可以通過直接細胞-細胞接觸阻斷TCR信號和IL-2信號來抑制傳統(tǒng)的T細胞增殖[13]，還可以產(chǎn)生IL-10和TGF-β來抑制其他T細胞亞群的發(fā)育和功能。其中IL-10可抑制RSV感染小鼠的疾病和炎癥，研究[14]發(fā)現(xiàn)IL-10是控制急性病毒性肺感染炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，IL-10缺乏小鼠的T細胞不能自我調(diào)節(jié)IFN-γ的產(chǎn)生，這可能導(dǎo)致IL-10缺乏小鼠RSV感染后期免疫損傷的加劇。IL-35是IL-12異二聚體細胞因子家族的新成員，可通過抑制Th2相關(guān)細胞因子，如IL-17 等的產(chǎn)生，限制Th2細胞增殖，從而逆轉(zhuǎn)Th2細胞依賴性氣道高反應(yīng)。Treg 細胞主要通過產(chǎn)生IL-35，將Th17細胞阻滯在G1期，而不是誘導(dǎo)細胞凋亡，從而抑制Th17細胞分化和IL-17因子釋放來發(fā)揮免疫抑制作用，并具有誘導(dǎo)iTr35(IL-35誘導(dǎo)的CD4+Treg細胞)增殖的能力[15]。動物實驗中小鼠體內(nèi)IL-35水平升高可顯著誘導(dǎo)Treg細胞和Th2增強，而體外研究提供了相似的結(jié)果，提示IL-35對T細胞亞群的進化具有免疫抑制作用。IL-35顯著抑制CD4+T細胞增殖和IL-2釋放，增加Treg細胞和IL-10[16]。臨床研究中，唐艷麗等[17]發(fā)現(xiàn)毛細支氣管炎患兒Treg細胞比例以及血清IL-4、IL-10水平在治療前明顯低于對照組，治療后較前明顯升高。本研究與其研究結(jié)果基本一致，Treg、IL-10、IL-35在病例組和對照組間有差異，病例組明顯降低，重癥組愈加顯著，說明Treg增殖抑制和IL-10、IL-35的分泌減少在本病的免疫機制中起著重要的作用。IL-35與Th17/Treg、Th17和IL-17呈負相關(guān)，說明IL-35可能是抑制Th17和IL-17的重要因子。通過logistic回歸分析，我們探討了重癥與輕癥毛細支氣管炎相關(guān)因素，最終發(fā)現(xiàn)Th17/Treg、IL-17和IL-6是毛細支氣管炎發(fā)展為重癥的獨立危險因素。

綜上所述，Th17/Treg免疫失衡，特別是Th17及其分泌的促炎因子IL-17、IL-6的過度增殖和分泌降低了機體對病毒清除能力，氣道內(nèi)黏液增多，炎癥反應(yīng)加劇，可能是導(dǎo)致毛細支氣管炎患兒病情的加重并延長住院時間的重要因素。而IL-35可能是抑制Th17和IL-17的細胞因子，成為一種針對毛細支氣管炎免疫失衡新的治療和預(yù)防策略。