小黃花茶（Camellia luteoflora Y.K.Li）花和葉中揮發(fā)性成分的分析

金瑭，代玉烜，王東，徐海霞，王麗

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610064）

小黃花茶（Camellia luteofloraY.K.Li），隸屬于山茶科山茶屬，是我國(guó)的特有物種，目前僅在貴州赤水及四川瀘州發(fā)現(xiàn)其分布[1],[2]。小黃花茶因具有與金花茶同樣的花色及其分布的狹域性而受到人們的關(guān)注，但相關(guān)研究目前主要集中在植物生理、種群生態(tài)、繁育等領(lǐng)域[3]。野生小黃花茶蟲害較多，常受天?？?、葉甲科、蚜蟲科、螞蟻和潛葉蛾的侵害[4]。植物的揮發(fā)油往往對(duì)植食性昆蟲具有引誘和寄主定位作用。如油菜中的3種硫氰酸酯對(duì)藍(lán)莢象甲（Ceutorhynchus assimilis）成蟲有強(qiáng)烈的引誘作用[5]。茶樹葉中的(Z)-3-己烯-1-醇，(Z)-3-己烯乙酸酯和芳樟醇會(huì)吸引茶小綠葉蟬（Empoasca onukii）成蟲[6]，這種吸引力會(huì)引起或加劇蟲害。病蟲害被認(rèn)為是影響小黃花茶正常繁衍生長(zhǎng)的主要因素之一，因此，研究小黃花茶的揮發(fā)油成分，對(duì)其栽培管理過(guò)程中病蟲害的防治具有十分重要的意義。

另一方面，中國(guó)擁有4000多年的茶歷史，早在《神農(nóng)百草經(jīng)》中就有用茶葉“解毒”的記載。據(jù)調(diào)查，四川省瀘州的山民將小黃花茶的花風(fēng)干后作為茶飲，其茶品呈淡黃色，并具有特殊的香氣。茶的揮發(fā)性成分不僅是評(píng)價(jià)茶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[7]，而且還具有抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗炎和抗氧化等藥理活性[8]。植物的揮發(fā)性成分較為復(fù)雜，其組成還受植物的生長(zhǎng)器官、生長(zhǎng)環(huán)境等因素的影響。前人雖然檢測(cè)了小黃花茶葉片中茶多酚和咖啡堿的含量[9]，但對(duì)于其揮發(fā)性成分的研究卻未見報(bào)道。因而，人們對(duì)小黃茶的化學(xué)成分、保健價(jià)值等還缺乏相應(yīng)的認(rèn)識(shí)，這種飲用方式存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性。

揮發(fā)性成分的提取常用水蒸氣蒸餾法、壓榨法、溶劑萃取法等。不同的提取方法在其組成上有所差異。相較而言，超聲輔助提取法（Ultrasonic-Assisted Extraction，UAE）具有時(shí)間短、易操作、得率高和成本低等特性，華燕青等人[10]在提取薄荷揮發(fā)油時(shí)發(fā)現(xiàn)UAE的平均得率、薄荷醇和薄荷酮的得率明顯高于水蒸氣蒸餾法；頂空固相微萃取法（Head Space Solid-Phase Micro-Extractions，HS-SPME）則具有易操作、簡(jiǎn)便、提取得率高、重復(fù)性好和減少對(duì)樣品預(yù)處理的優(yōu)點(diǎn)，常用于致香成分研究[11]，王強(qiáng)強(qiáng)[12]等人在提取八角茴香中的烯烴類、酮類、芳香烴類化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)，HS-SPME要優(yōu)于溶劑萃取法。

因此，本文采用HS-SPME和UAE兩種方法分別提取小黃花茶的花和葉的揮發(fā)油，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）對(duì)其成分進(jìn)行分析，研究不同提取方法對(duì)其揮發(fā)性成分組成的影響，以及不同器官間的揮發(fā)油成分的差異，以期為小黃花茶栽培管理中的蟲害防治和開發(fā)利用提供理論依據(jù)和相應(yīng)的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料采集

小黃花茶（Camellia luteofloraY.K.Li）的葉和花于2020年10月采集于四川省瀘州市古藺縣。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

正己烷（AR），無(wú)水Na4SO4（AR），液氮，SB25-12DTN超聲波清洗機(jī)（600 W），BUCHI R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，GCMS-QP2010 Plus（日本SHIMADZU），萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

液氮中研磨葉子至粉碎，過(guò)60目篩。

1.3.2 揮發(fā)油提取

HS-SPME：分別稱取2 g花和葉，加入20 mL頂空瓶中，水浴鍋60 ℃，平衡30 min，萃取45 min，270 ℃下解析2 min，270 ℃老化30 min，將此法提取的花揮發(fā)油樣品命名為GH，葉揮發(fā)油樣品命名為GY。

UAE：分別取2 g花和葉子的粉末放入三角燒瓶，按照料液比1:20加入40 mL正己烷，80 ℃水浴超聲1 h后取出過(guò)濾，重復(fù)提取兩次，合并濾液，減壓濃縮后加入2 mL正己烷充分溶解，600 r/min離心10 min，將此法提取的花揮發(fā)油樣品命名為CH，葉揮發(fā)油樣品命名為CY。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）聯(lián)用分析

GC-MS條件：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純度氦氣；流速；1 mL/min；分流比：5:1；進(jìn)樣量1 μL。EI電力源，能量70 eV；離子源溫度200 ℃；接口溫度220 ℃；溶劑延遲0.1 min，掃描范圍33～500m/z。

升溫程序1：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min的速度上升到150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速度繼續(xù)上升到280 ℃，保持3 min。

升溫程序2：50 ℃保持5 min，以10 ℃/min的速度上升到260 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度繼續(xù)上升到290 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜檢索：NIST08.LIB。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用NIST 98.L譜庫(kù)對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行串連檢索和人工解析，質(zhì)譜匹配度＞80%作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，使用面積歸一法計(jì)算相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 總離子流圖

樣品GH和GY采用升溫程序1，樣品CH和CY采用升溫程序2，總離子流圖如圖1所示。

圖1 樣品GH、GY、CH和CY的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of GH, GY, CH and CY

2.2 四個(gè)樣品揮發(fā)性成分的組成

鑒定出的化學(xué)成分和相對(duì)含量如表1所示。

表1 樣品GH、GY、CH和CY的GC-MS分析結(jié)果Table 1 Analysis results of GH, GY, CH and CY by GC-MS

從小黃花茶中共檢測(cè)到137種化學(xué)成分，鑒定出121種?；ㄖ泄矙z測(cè)到88種，鑒定出74種，其中GH中有46種，CH中有28種。葉中共檢測(cè)到85種，鑒定出72種，其中GY中有49種，CY中有24種。

2.2.1 HS-SPME法的提取組分

GH樣品中檢測(cè)到50種揮發(fā)性成分，鑒定出46種，占該樣品揮發(fā)性成分含量的98.53%。包含13種萜類化合物（38.36%）、9種芳香族化合物（8.47%）和24種脂肪族化合物化合物（51.70%），各類中含量最高的分別為芳樟醇（33.12%）、甲苯（4.43%）和反式-2-己烯醛（17.51%）。

GY樣品中檢測(cè)到51種揮發(fā)性成分，鑒定出49種，占該樣品揮發(fā)性成分含量的99.47%。包含17種萜類化合物（9.21%）、10種芳香族化合物（4.05%）和22種脂肪族化合物（86.21%），各類中含量最高的分別為芳樟醇（2.14%）、間氯二苯（1.13%）和反式-2-己烯醛（40.73%）。

2.2.2 UAE法的提取組分

CH樣品中檢測(cè)到31種揮發(fā)性成分，鑒定出28種，占該樣品揮發(fā)性成分含量的63.59%。包含2種萜類化合物（2.83%）、1種甾類化合物（10.58%）、2種芳香族化合物（4.26%）和23種脂肪族化合物（45.92%），各類中含量最高的分別為1,6,10,14,18,22-Tetracosahexaen-3-ol，2,6,10,15,19,23-hexamethyl-，(all-E)-（1.68%）、(3BETA,23E)-9,19-環(huán)羊毛甾-23-烯-3,25-二醇（10.58%）、Terephthalic acid，di(2-ethylhexyl)ester（4.09%）和三十六烷（9.17%）。

CY樣品中檢測(cè)到36種揮發(fā)性成分，鑒定出24種，占該樣品揮發(fā)性成分含量的72.31%。包含6種萜類化合物（31.49%）、2種甾類化合物（3.76%）、5種芳香族化合物（11.93%）和11種脂肪族化合物（25.13%），各類中含量最高的分別為角鯊烯（17.31%）、為星魚甾醇（2.03%）、維生素E（9.34%）和α-香樹脂醇乙酸酯（9.84%）。

接上頁(yè)

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2.2.3 兩種提取方法的揮發(fā)性成分的種類差異

HS-SPME提取到23種萜類（23.84%）、13種芳香族化合物（6.27%）和38種脂肪族化合物（69.10%），未鑒定出的成分占0.79%。UAE提取7種萜類（17.50%）、3種甾類（7.31%）、7種芳香族化合物（8.25%）和32種脂肪族化合物（36.22%），未鑒定出的成分占30.72%。相較而言，HS-SPME的鑒定率更高，提取到更多的萜類和芳香族類，沒(méi)有提取到甾類。

2.2.4 花葉揮發(fā)油成分綜合分析

綜合兩種提取方法的結(jié)果，花揮發(fā)油中含有15種萜類化合物（20.78%），1種甾類化合物（5.34%），11種芳香族化合物（6.42%），46種脂肪族化合物（48.52%）；含量最高的為芳樟醇（16.71%），其次是反式-2-己烯醛（8.83%）、乙醇（5.88%）、(3BETA,23E)-9,19-環(huán)羊毛甾-23-烯-3,25-二醇（5.34%）和己醛（4.77%），含量不低于1%的有16種，未鑒定出14種。

葉揮發(fā)油中含有23種萜類化合物（20.61%），2種甾類化合物（1.90%），14種芳香族化合物（8.06%），33種脂肪族化合物（56.39%）；含量最高的為反式-2-己烯醛（20.63%），其次為己醛（10.26%）、角鯊烯（8.77%）、α-香樹脂醇乙酸酯（4.98%）和維他命E（4.73%），含量不低于1%的有18種，未鑒定出13種（圖2）。

圖2 小黃花茶花和葉的揮發(fā)油各類化合物種類及含量占比Fig.2 Types and contents of volatile oil in Camellia luteoflora Y.K.Li

花和葉中共同檢測(cè)到的化合物有25種，分別占花揮發(fā)性成分含量的44.82%，葉的47.69%，其中含量差異最大的為芳樟醇，相差15.62%，其次為反式-2-己烯醛和己醛，分別相差11.80%和5.49%（圖3）。

圖3 小黃花茶花和葉共有化合物及含量的百分比堆積圖Fig.3 Percentage accumulation diagram of common compounds and their contents in flowers and leaves of Camellia luteoflora Y.K.Li

3 結(jié)論

3.1 小黃花茶花和葉揮發(fā)性成分的差異

小黃花茶中共鑒定出121種成分，包括25種花和葉共有、49種花特有、以及47種葉特有的化合物?；ㄈ~共有成分中，花中含量高于葉的有8種，葉中含量高于花的有17種，花和葉中含量相差大于1%的有10種。其中芳樟醇、反式-2-己烯醛和己醛的含量差異較為明顯?；ǖ奶赜谐煞种?，含量高于1%的化合物有10種。主要有乙醇、(3BETA,23E)-9,19-環(huán)羊毛甾-23-烯-3,25-二醇、二十烷、1-溴三十烷和水楊酸乙酯等。葉的特有成分中，含量高于1%的化合物有8種，主要有角鯊烯、木栓酮、維他命E和α-香樹脂醇乙酸酯等。

植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的特異性。宋雙紅[13]等發(fā)現(xiàn)黃芩（Scutellaria baicalensis）的花、莖葉、根和種子揮發(fā)油的成分和相對(duì)含量各不相同。張康健研究杜仲（Eucommia ulmoides）葉次生代謝物生長(zhǎng)的積累動(dòng)態(tài)時(shí)認(rèn)為其葉片中的次生代謝產(chǎn)物有些不能被轉(zhuǎn)移和運(yùn)輸[14]。因此，小黃花茶的花和葉在揮發(fā)性組分上的差異性，可能與其器官間揮發(fā)油含量的積累和貯存的獨(dú)立性，以及其代謝途徑的不完全開放性有關(guān)。

3.2 HS-SPME法和UAE法的提取組分差異

兩種方法提取的揮發(fā)性成分幾乎完全不同。從總離子圖看，HS-SPME法所的化合物保留時(shí)間集中在0.5～21 min內(nèi)，是一些沸點(diǎn)較低、分子量較小的化合物。UAE法所得化合物GC-MS保留時(shí)間集中在12～48 min內(nèi)，沸點(diǎn)較高、分子量較大。

HS-SPME法是集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的無(wú)溶劑提取技術(shù), 簡(jiǎn)單易行,在香氣研究中得到廣泛應(yīng)用[15]。在小黃花茶中，HS-SPME提取得到的萜類化合物達(dá)到總量的38.36%（花），遠(yuǎn)超UAE的2.83%（花），而且鑒定率高達(dá)99.21%，敏感度極高。此外，在芳樟醇的提取上，HS-SPME法（33.12%）顯著優(yōu)于UAE法（2.14%）。

與HS-SPME相比，UAE法所得的揮發(fā)油物質(zhì)較少。胡均鵬等人[16]比較了不同提取方法對(duì)安化茯磚茶揮發(fā)油成分的影響，認(rèn)為UAE法中超聲波對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)具有一定的破壞作用，此外所使用溶劑的極性也會(huì)影響到其組成。本研究中對(duì)芳香族類化合物的提取以UAE法更優(yōu)，可達(dá)總量的11.93%（葉），高于HS-SPME法的4.05%（葉），且能提取到更多的直鏈和帶支鏈烷烴。此外，UAE還提取到較高含量的角鯊烯（17.31%），對(duì)其超聲時(shí)間、功率和溫度等條件進(jìn)一步優(yōu)化后有望成為從小黃茶茶中提取角鯊烯的方法。

3.3 小黃花茶揮發(fā)油中具有生物活性的成分

小黃花茶中揮發(fā)性油中含量較高的有芳樟醇、角鯊烯、甲苯、維他命E、己醛、反式-2-己烯醛和水楊酸甲酯等，這些成分除了可作香料、化工原料外，大都具有一定的生物活性。如芳樟醇作為香料和調(diào)味劑應(yīng)用于日化品和食品加工中，是合成維生素E、A的重要中間體，另外具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗氧化等作用[17],[18]，且天然芳樟醇因具有旋光性而在醫(yī)藥價(jià)值上高于合成芳樟醇。茶葉中，芳樟醇是含量很高的香氣成分之一，與信陽(yáng)毛尖（10.35%）[7]和龍井茶（13.75%）[19]等相比，小黃花茶中的含量高達(dá)33.12%，作為飲品其香氣更濃。

此外，反式-2-己烯醛能顯著抑制梨果黑斑病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)[20]，并可通過(guò)熏蒸方式來(lái)防治松材線蟲[21]；角鯊烯是一種珍貴的天然產(chǎn)物，具有保健、防癌抗癌、抗氧化和防輻射等作用，廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域[22]；天然維生素E穩(wěn)定，不僅是理想的食品抗氧化劑，還具有抗不育和抗衰老功能。因此，小黃花茶揮發(fā)油具有較大的開發(fā)利用潛力。

3.4 小黃花茶揮發(fā)油成分與蟲害

據(jù)報(bào)道，芳樟醇對(duì)葉甲科的馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）雄蟲具有很強(qiáng)的引誘作用[23]；己醛能夠引誘蚜科的茶蚜（Toxoptera aurantii）[24]。郭曉春等研究了油茶揮發(fā)物對(duì)刺股溝臀肖葉甲的引誘，發(fā)現(xiàn)壬醛（2.21%）、芳樟醇（12.96%）和香葉醇（7.52%）具有明顯的引誘效果[25]。蟲害是造成野生小黃花茶種群數(shù)量稀少的主要原因之一，其昆蟲主要來(lái)源于天牛科、葉甲科、蚜科等[4]。我們推測(cè)其蟲害原因可能與該植物中所含的上述揮發(fā)性成分有關(guān)，但尚需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。因此，在栽培管理上除了噴灑藥物和熏蒸防治措施外，還應(yīng)該通風(fēng)，降低栽培溫度以減少其揮發(fā)油的散發(fā)，從而減少對(duì)害蟲的吸引。

總之，小黃花茶含有多種具有生物活性和藥用價(jià)值的成分，具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。然而這其中也不乏昆蟲的“引誘劑”，因此需要進(jìn)一步研究小黃花茶的自我防御機(jī)制，并采取相應(yīng)的措施，從而提高小黃花茶的栽培管理水平。