茶多酚在模擬胃腸消化過(guò)程中含量及活性的變化規(guī)律

李玉壬，王瑞，王旭捷，陳春鳳，楊慧，羅忠芳，楊曉萍

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

茶多酚（TP）是茶葉中的一種天然活性成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、提高膜穩(wěn)定性等活性[1]；同時(shí)，TP還能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的組成、改善腸道微環(huán)境，被廣泛應(yīng)用于改善腸道健康等方面，成為了代謝綜合征治療的熱點(diǎn)選擇[2]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)TP在人體胃腸環(huán)境中的利用率并不可觀。Henning等[3]發(fā)現(xiàn)TP在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)胃腸消化后僅有10.00%的有效成分被吸收；趙超藝[4]等通過(guò)研究小鼠胃腸消化過(guò)程中TP的變化情況，發(fā)現(xiàn)兒茶素在小腸內(nèi)的損失率高達(dá)30.00%。這些現(xiàn)象是由TP在消化過(guò)程中的不穩(wěn)定性和腸道的低吸收率導(dǎo)致的[5]。胃酸和蛋白酶等物質(zhì)能促進(jìn)TP中的沒(méi)食子酸酯和沒(méi)食子酸降解成酚酸及其甘氨酸結(jié)合物等簡(jiǎn)單復(fù)合物[6]，降解產(chǎn)物一部分先在胃部被吸收，接著在小腸被少量吸收，剩余部分被結(jié)腸中的微生物分解釋放，最終導(dǎo)致TP的生物利用度大幅度降低[7]。這使得與TP相關(guān)的深加工制品在人體消化過(guò)程中難以保持活性，無(wú)法充分發(fā)揮其原有特性。因此，如何提高胃腸消化后TP的生物利用率，成為T(mén)P深加工產(chǎn)品急需解決的問(wèn)題。

探究模擬消化過(guò)程中TP成分含量和活性的變化情況對(duì)研究如何提高其在胃腸中的生物利用率極為重要。本研究通過(guò)構(gòu)建模擬消化模型，探究TP在不同消化階段的含量和抗氧化活性的變化情況，同時(shí)選取具有代表性的腸道細(xì)菌作為研究對(duì)象，分析模擬消化前后TP對(duì)主要腸道細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，為提高TP在胃腸中的生物利用度提供新的試驗(yàn)依據(jù)，并為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)體內(nèi)高活性的TP深加工制品提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TP（≥98%），安徽紅星藥業(yè)股份有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC8739；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC4356均購(gòu)買(mǎi)于廣東省微生物研究所。

胃蛋白酶（Pepsin 1:3000）和福林酚，Biosharp公司；胰酶、粘蛋白、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，BR）和2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯丙噻唑琳-6-磺酸二銨鹽（ABTS，98%），上海源葉生物科技有限公司；脂肪酶（10萬(wàn)U/g）和2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ，99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豬膽鹽，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；IS-RDD3型臺(tái)式恒溫振蕩器，美國(guó)Crystal公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；生化培養(yǎng)箱，天津市萊伯特瑞儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇信凈化設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 模擬消化樣品制備

分別按王瑞等[8]的方法配制模擬胃液、模擬十二指腸液和模擬膽汁及構(gòu)建模擬消化模型。模擬胃腸消化過(guò)程具體操作如下：取TP 0.040 g置于三角瓶中，加入20 mL現(xiàn)配的人工模擬胃液，于37 ℃恒溫，110 r/min振蕩器中分別進(jìn)行不同時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）的模擬胃消化處理；胃消化后，先用0.9 mol/L NaHCO3將模擬胃消化液pH值調(diào)至6.0±0.2，然后加入30 mL模擬腸液（20 mL現(xiàn)配的模擬十二指腸液和10 mL現(xiàn)配的模擬膽汁組成），混合均勻后于37 ℃恒溫，110 r/min振蕩器中再分別進(jìn)行不同時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）的模擬腸消化處理。分別取不同消化時(shí)間的胃消化液、腸消化液，于冰浴條件下鈍化酶的活性、離心（4500 r/min）10 min，取上清液分別用于測(cè)定TP的含量、主要兒茶素組分及其抗氧化活性。

1.3.2 TP含量測(cè)定

參考GB/T 8313-2008測(cè)定[9]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。分別測(cè)定不同消化階段的樣品溶液于765 nm處的吸光值，計(jì)算求得TP含量，結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量（g GAE/g TP）表示。

1.3.3 高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)兒茶素主要組成物質(zhì)

參考GB/T 8313-2008[10]和Wu等[11]采用HPLC法測(cè)定兒茶素組分及含量。使用Agilent TC-C18分離柱（0.45 μm），在35 ℃柱溫下通過(guò)流動(dòng)相A（0.1%Formic acid和超純水溶劑）和B相（0.1% Formic acid和Methanol溶劑）進(jìn)行色譜分離，在278 nm處檢測(cè)各組分含量。

1.3.4 抗氧化活性

1.3.4.1 總抗氧化能力

參考Benzie等人[12]的方法，取10.0 mM TPTZ溶液、20.0 mM氯化高鐵溶液、0.3 M醋酸鈉緩沖溶液（pH 3.6）以1:1:10的比例均勻混合，此溶液即為T(mén)PTZ反應(yīng)液。取100 μL待測(cè)液，加入37 ℃水浴加熱的TPTZ反應(yīng)液3 mL，恒溫水浴反應(yīng)30 min后，在593 nm處的吸光度。以不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mM）的硫酸亞鐵繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以FeSO4當(dāng)量摩爾數(shù)（mmol Fe2+/g TP）表示。

1.3.4.2 DPPH·清除能力

參考Blois[13]測(cè)定方法，取2.0 mL待測(cè)液加入2.0 mL DPPH乙醇溶液，搖勻后置于黑暗中室溫下反應(yīng)30 min，并在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度（Ax）。按下式計(jì)算DPPH·清除率（IDPPH，%）：

式中：A0，空白對(duì)照吸光值；Ax，樣品吸光值；Ay，參比液吸光值。

以不同質(zhì)量濃度（3、5、10、15、20 μg/mL）的抗壞血酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以抗壞血酸當(dāng)量（g VCE/g TP）表示。

1.3.4.3 ABTS+·清除能力

參考Re等[14]和Thaipong等[15]方法，具體操作如下：7.0 mM ABTS水溶液與2.45 mM KPS溶液以1:1體積比例混合均勻，黑暗中靜置16 h以上，得ABTS+·儲(chǔ)備液。用95%乙醇溶液在避光條件下稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液，使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.05，即ABTS+·反應(yīng)液。依次取200 μL待測(cè)液，加入3.0 mL ABTS+·反應(yīng)液混合均勻，室溫于黑暗中反應(yīng)1.0 h，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。按下式計(jì)算樣品ATBS+·清除能力（IABTS，%）：

式中：A0，空白對(duì)照吸光值；Ax，樣品的吸光值。

以不同質(zhì)量濃度（0、16.0、32.0、48.0、64.0、80.0 μg/mL）的抗壞血酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以抗壞血酸當(dāng)量（g VCE/g TP）表示。

1.3.5 TP對(duì)腸道細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

1.3.5.1 菌種的活化和菌懸浮液的制備

將大腸桿菌接種到斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，活化后的大腸桿菌轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)20 h，制備含菌量為105CFU/mL的菌懸液，備用；將嗜酸乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h，活化后的嗜酸乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，制備含菌量為108～109CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.5.2 大腸桿菌抑菌試驗(yàn)

分別向1.0 mL無(wú)菌水、無(wú)菌未消化TP溶液、無(wú)菌腸液和消化液中加入100 μL大腸桿菌菌液，置于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)12 h，平板計(jì)數(shù)[16]。

1.3.5.3 對(duì)嗜酸乳桿菌增殖的影響

分別向1.0 mL無(wú)菌水、無(wú)菌未消化TP溶液、無(wú)菌腸液和消化液中加入100 μL嗜酸乳桿菌菌液，置于37 ℃靜置24 h，平板計(jì)數(shù)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬消化對(duì)TP含量與主要成分的影響

2.1.1 模擬消化對(duì)TP含量的影響

如圖1所示，模擬胃腸消化后，TP含量顯著降低（p＜0.05）。與未消化相比，胃消化后TP含量明顯降低了12%，但消化時(shí)間對(duì)含量變化無(wú)顯著影響（p＞0.05）。腸消化后TP含量大幅度地降低了35.90%～46.10%，且在0.5～1.5 h之間含量存在顯著性差異（p＜0.05），1.5 h后含量變化趨于穩(wěn)定。比較發(fā)現(xiàn)，TP在腸消化后損失量是胃部的3.60～4.20倍，說(shuō)明相較于腸部環(huán)境，TP在胃部環(huán)境中更加穩(wěn)定。這與Tenore等[18]研究結(jié)果一致。造成這種差異的原因可能是TP在腸道的弱堿性環(huán)境下會(huì)發(fā)生氧化、聚合、降解等反應(yīng)，導(dǎo)致其含量降低；同時(shí)，溶液中的氧氣也會(huì)促進(jìn)上述反應(yīng)的發(fā)生，使得TP的損失率進(jìn)一步的提高[19]。

圖1 模擬消化對(duì)TP含量的影響Fig.1 Effect of simulated digestion on the content of tea polyphenols

2.1.2 模擬消化對(duì)兒茶素主要成分的影響

兒茶素是TP的主要成分，約占TP總量的65.00%～80.00%，主要包括EGCG、ECG、EGC、EC、GC、GCG、C等[20]。由表1可知，模擬消化后兒茶素各組分均發(fā)生顯著變化。兒茶素總量降低了86.40%～91.80%；胃消化后，兒茶素類含量降低了19.90%，其中GCG降低幅度最大，為32.50%，但EGC增加了13.80%。腸消化后，兒茶素類含量顯著降低了86.40%～91.80%，其中EGCG降低幅度最大，為98.40%～98.70%，而GC顯著增加，為97%～114%，這可能與ECG和EGC在消化中的異構(gòu)化作用有關(guān)[19,21]。以上結(jié)果說(shuō)明胃腸消化對(duì)兒茶素穩(wěn)定性具有顯著影響，EGCG和EGC對(duì)腸液pH環(huán)境更為敏感，這與Tenore等[18]報(bào)道結(jié)果一致。

表1 模擬腸消化前后兒茶素主要成分含量的變化Table 1 Changes on the content of the major components of tea polyphenols before and after simulated gastrointestinal digestion

2.2 模擬消化對(duì)TP抗氧化活性的影響

2.2.1 總抗氧化能力

如圖2所示，模擬胃腸消化后，TP的總抗氧化能力（FRAP）顯著降低（p＜0.05）。胃消化后，F(xiàn)RAP顯著降低了17.10%～18.30%；腸消化后顯著降低了40%～45%；隨著模擬消化時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)RAP逐漸降低；不同時(shí)間處理對(duì)胃消化TP的FRAP無(wú)明顯作用（p＞0.05），但對(duì)腸消化有顯著差異（p＜0.05）；通過(guò)相關(guān)性分析可知，在模擬胃腸消化的不同階段，F(xiàn)RAP隨著TP含量的增加而增加。相對(duì)于胃消化階段，腸消化后TP的FRAP大幅度降低（p＜0.05），這可能是pH的影響，由FRAP法的pH環(huán)境可知pH=3.6是測(cè)定時(shí)的最適條件，與胃消化液的pH相近，但腸消化液的pH偏堿性，會(huì)對(duì)FRAP的測(cè)定產(chǎn)生不利影響[22]。

圖2 模擬消化對(duì)TP總抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of simulated digestion on the FRAPs of tea polyphenols

2.2.2 DPPH·清除能力

如圖3所示，模擬胃腸消化后，TP的DPPH·清除能力顯著降低（p＜0.05）。胃消化后，TP的DPPH·清除能力降低了6.40%～7.70%；腸消化后顯著降低了58.30%～64.40%；通過(guò)相關(guān)性分析可知，在模擬胃腸消化的不同階段，DPPH·清除能力隨著TP含量的增加而增加。此外，經(jīng)過(guò)模擬消化后，腸消化階段TP對(duì)DPPH·清除能力的降低幅度是胃消化階段的8.37倍，說(shuō)明相對(duì)于胃消化，腸部環(huán)境對(duì)TP的DPPH·清除能力的影響更為顯著。

圖3 模擬消化對(duì)TP清除DPPH·能力的影響Fig.3 Effects of simulated digestion on the DPPH· scavenging abilities of tea polyphenols

2.2.3 ABTS+·清除能力

如圖4所示，模擬胃腸消化后，TP的ABTS+·清除能力顯著降低（p＜0.05）。胃消化后，ABTS+·清除能力顯著降低了38.60%～39.60%；腸消化后降低了10.80%～18.10%；在胃消化階段，ABTS+·清除能力與TP含量變化趨勢(shì)相同，二者呈正相關(guān)（R2=0.97），但在腸消化階段，ABTS+·清除能力在1.0 h后開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與TP含量變化趨勢(shì)不同，二者相關(guān)性不明顯（R2=0.29）。比較胃腸消化結(jié)果可知，腸消化后ABTS+·清除率的降低幅度遠(yuǎn)小于胃消化階段，僅是胃消化的0.46倍。說(shuō)明多酚類ABTS+·清除率呈現(xiàn)pH依賴性，隨著pH升高，清除能力變強(qiáng)。這與多酚化合物芳香環(huán)酚性羥基在弱堿性pH環(huán)境下去質(zhì)子化有關(guān)[23]，在腸液pH環(huán)境中TP的去質(zhì)子化更易發(fā)生，從而增強(qiáng)了TP的ABTS+·清除率。此外，研究結(jié)果還表明胃消化后，TP清除ABTS+·能力的降低幅度是清除DPPH·能力的5.10倍，是FRAP的2.20倍，由此可知胃消化對(duì)TP各抗氧化活性的影響不同。

圖4 模擬消化對(duì)TP清除ABTS+·能力的影響Fig.4 Effect of simulated digestion on the ABTS+· scavenging abilities of tea polyphenols

2.3 TP模擬消化前后對(duì)腸道細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

大腸桿菌是腸道中常見(jiàn)的致病性細(xì)菌，其在機(jī)體內(nèi)會(huì)促使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生胺、氨等有害物質(zhì)，對(duì)腸道帶來(lái)直接損傷，同時(shí)分解產(chǎn)物一部分被吸收，對(duì)人體產(chǎn)生不利影響[24]。由表2可知，TP在模擬胃腸消化前后均能明顯抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，具有顯著的抑菌活性，并且消化后TP的抑菌效果優(yōu)于消化前。這可能與兒茶素經(jīng)過(guò)消化后轉(zhuǎn)化為乳酸Ⅰ型代謝產(chǎn)物和Ⅱ型代謝產(chǎn)物等同樣具有一定抑菌活性的物質(zhì)有關(guān)[25]。

表2 模擬腸消化前后TP對(duì)腸道細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of tea polyphenols on the gut bacteriabefore and after simulated gastrointestinal digestion

嗜酸乳桿菌作為腸道有益菌，在一定范圍內(nèi)可以改善人體腸道微生物菌群的平衡，從而提高機(jī)體的健康水平[26]。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)消化前的TP能明顯促進(jìn)嗜酸乳桿菌的增殖，但在模擬消化后TP對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，這可能與腸液pH有關(guān)。有研究指出嗜酸乳桿菌的最適生長(zhǎng)pH為5.5～6.5，隨著pH值的升高，偏堿性環(huán)境會(huì)對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)生抑制作用，降低其存活率[27]，而模擬腸液呈弱堿性不利于其生長(zhǎng)，試驗(yàn)對(duì)照樣（嗜酸乳桿菌在不加TP的腸液中培養(yǎng)）中同樣沒(méi)有看到菌落的生長(zhǎng)，進(jìn)一步說(shuō)明腸液pH是影響其生長(zhǎng)的主要因素。

3 結(jié)論

3.1 本文通過(guò)體外模擬消化的方法，分析了在此過(guò)程中TP的含量、主要成分和抗氧化活性的變化情況，以及對(duì)腸道主要細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP經(jīng)過(guò)模擬消化后含量顯著降低（p＜0.05）；其中，EGCG、GCG等兒茶素類物質(zhì)含量大幅度降低，而EGC和GC含量相對(duì)增加；比較胃腸消化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TP在胃部環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，含量降低了12%，而在腸部極易分解，大幅度下降了35.90%～46.10%；模擬胃腸消化顯著降低了TP的FRAP，以及對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除能力（p＜0.05），且不同消化階段TP的抗氧化能力與含量呈正相關(guān)，但腸消化階段的ABTS+·清除能力與TP含量相關(guān)性并不明顯；TP對(duì)大腸桿菌具有顯著抑菌效果，經(jīng)過(guò)模擬消化后抑制作用增強(qiáng)，但消化后的TP對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)不再產(chǎn)生影響，產(chǎn)生這種現(xiàn)象是因?yàn)槟c道的偏堿性環(huán)境不滿足嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)條件。

3.2 在人體胃腸消化過(guò)程中，不同pH環(huán)境、消化酶、腸道微生態(tài)以及食品基質(zhì)之間存在互相影響，這些因素的綜合作用會(huì)導(dǎo)致TP的含量和生物活性發(fā)生不同的變化。因此，探究人體消化過(guò)程對(duì)TP含量和活性的影響時(shí)，需要綜合考慮胃腸環(huán)境的多樣性，這些問(wèn)題還有待進(jìn)一步的研究。