PDA@Ag納米復合材料的制備及抑菌性能研究

解修超，蘭阿峰，劉二奴，郭少波，鄧百萬

(1. 陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2. 陜西理工大學 化學與環(huán)境科學學院，陜西 漢中 723000)

抗生素作為重要的殺菌劑，具有殺菌性能高、靶向性能強、副作用小等優(yōu)點被廣泛應用在醫(yī)藥和臨床領域[1]。抗生素的開發(fā)難度大、經(jīng)濟效益低、更新周期長，限制了抗生素的發(fā)展[1-3]。但環(huán)境的改變、抗生素的泛濫使用，會導致細菌的 DNA堿基排列發(fā)生改變。細菌通過調(diào)節(jié)自身多機制適應和產(chǎn)生特異蛋白，抵抗抗生素的靶向結合，或產(chǎn)生滅活酶直接破壞抗生素，從而產(chǎn)生大量的抗藥菌甚至“超級耐藥菌”[1-2]，人類有可能陷入無藥可用的時代。

無機金屬抗菌劑如納米金、銀、鈀、鉑、汞等都具有一定的殺菌性[1-5]，并對細菌造成不可修復的損傷，其中納米銀由于抑菌性能高，成本低廉、抑菌持久、對人體幾乎無毒、廣譜抑菌等優(yōu)點成為理想的殺菌劑被廣泛應用在醫(yī)療和醫(yī)藥行業(yè)[3,5]。大多數(shù)納米銀系抑菌劑抑菌機理為：納米銀釋放出銀離子(Ag+)，Ag+和細菌細胞器中的蛋白質(zhì)、核酸等結合使發(fā)生不可逆變性而使細菌死亡；或納米銀粒子進入細胞內(nèi)，和細胞質(zhì)作用生成活性氧簇(ROS)，ROS極其不穩(wěn)定[5]，對大多數(shù)細菌的細胞器都具有很強的破壞性，對細菌造成不可修復的損傷。理論上說，納米銀粒子半徑越小，抑菌性能越強。這是因為細菌細胞壁都具有網(wǎng)狀結構的肽聚糖[6-9]，銀粒徑越小，表面能越大，和細菌細胞壁接觸面積越大，釋放出來的 Ag+越能滲透細菌細胞壁致使細菌死亡[9]但銀粒徑越小越易團聚，又會降低銀的抑菌性能。

一種有效的解決方法是將納米銀負載在比表面積較大的亞微球上來克服銀團聚問題[1,10]，用特異載體的還原性合成銀系核殼型復合材料。Abadikhah等[11]將納米銀負載在氧化石墨烯@二氧化鈦表面，合成 GO@TiO2@Ag，研究其對革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E. coli)的抑菌活性，結果表明該材料相比單質(zhì)銀抑菌率可提高至 90%以上；Kooti等[12]合成了CoFe2O4@SiO2@Ag復合材料，在對E. coli和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(S. aureus)的抑菌活性中，明顯提高了銀的抑菌性能。這說明將銀負載在有機/無機亞微球上能提高銀的抑菌效率，但在制備過程中需用還原劑把納米銀負載在亞微球表面，納米銀容易脫落，且多數(shù)還原劑有一定毒性。

多巴胺(DPA)具有良好的生物相容性，對人體無毒，自身多羥基具有一定的還原性，可以將Ag+還原成Ag0制備PDA@Ag復合材料[13-14]。本文以多巴胺為原料，通過自聚合制備聚多巴胺亞微球，以原位還原的方式在其表面負載納米銀，并與化學方法制備的納米銀作對比，采用多種手段對產(chǎn)物進行表征，研究其對S. aureus和E. coli的抑菌性能，探討其抑菌機制。

1 實驗部分

1.1 試劑和設備

1) 試劑。三羥甲基氨基甲烷，分析純，天津市大茂化學試劑廠；異丙醇，分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；多巴胺，試劑純，抗壞血酸，分析純，均為上海凜恩科技發(fā)展有限公司；硝酸銀與氯化鈉，分析純，廣州市鑫鉑化工有限公司；氨水(25%)，分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；酵母浸粉、胰蛋白胨和瓊脂，分析純，上海展云化工有限公司；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均由陜西省食用菌研究所提供。

2) 主要設備。X射線衍射儀(XRD，德國Bruker公司 D8 Advance)；透射電子顯微鏡(TEM，日本JEOL公司JEM 2010F)；雙光束紫外可見分光光度計(UV-Vis，島津公司UV-1900i)；X射線光電子能譜儀(XPS，日本Ulvac-Phi公司PHI Quantera II)；熱失重儀(TGA，北京恒久科技有限公司TGA-2)。

1.2 材料制備

1) 原位還原法制備 PDA@Ag納米復合材料。取122 mg三羥甲基氨基甲烷分散在100 mL異丙醇中，超聲分散均勻，加入250 mL的超純水攪拌10 min；加入375 mg多巴胺，攪拌36 h后得到PDA亞微球。用去離子水5000 r/min離心洗滌3次，60℃烘干備用。取0.425 g硝酸銀均勻分散在50 mL超純水中，滴加氨水配成銀氨溶液，均勻分散在上述制備的100 mg PDA干燥的固體亞微球中攪拌1.5 h得到PDA@Ag復合材料[13]。

2) 納米銀的制備[15]。稱取85 mg PVP加入到20 mL蒸餾水中，超聲分散均勻；加入85 mg AgNO3攪拌20 min，分散均勻后加入200 μL 5 mol/L NaCl溶液，在黑暗環(huán)境中攪拌20 min，合成AgCl膠體。取160 mL 0.05 mol/L抗壞血酸溶液加到250 mL錐形瓶中，逐滴加入22 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，攪拌10 min；加入AgCl溶膠，黑暗環(huán)境中反應2 h，去離子水在高速離心機15000 r/min離心洗滌3次，把固體產(chǎn)物納米銀顆粒儲存于真空干燥箱備用。

1.3 表征

將PDA-Ag樣品直接壓片，用XRD測試產(chǎn)物的XRD圖譜，選用Cu靶的Ka射線，工作電壓40 kV，工作電流 40 mA，掃描(2θ)角度 10°~90°，步長0.017°/s；用熱失重儀測試樣品的耐熱性能，稱量0.5 mg 左右樣品，測試溫度范圍為30~700℃，升溫速率為10℃/min；用TEM觀察樣品的形貌，樣品在乙醇溶液中均勻分散，在銅網(wǎng)上滴入兩滴懸浮溶液進行干燥處理，加速電壓為200 kV，最大放大倍數(shù)為1500 k。

LB固體培養(yǎng)基的制備：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂18 g(液體培養(yǎng)基不需要瓊脂)分散在1000 mL水中，在高溫滅菌鍋中121℃滅菌20 min，在超凈工作臺中倒平板備用。

細菌活化：在-80℃的冰箱中取出儲存菌，消融后在固體培養(yǎng)基中劃線，在生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12 h，挑出單菌落在超凈工作臺中放置于液體LB培養(yǎng)基中，搖床中37℃培養(yǎng)12 h。

1.4 抑菌實驗

1) 菌懸液制備。選用S. aureus和E. coli為模式菌，使用前隔夜活化。將稀釋在滅菌的蒸餾水中配成不同濃度，用無菌的生理鹽水把活化好的菌懸液稀釋到5×105CFU/mL。

2) 濾紙片擴散法(平行 3組)。在無菌環(huán)境下，首先取50 μL菌懸液均勻涂布在滅過菌的LB固體培養(yǎng)基上，其次用沾有 3 μL (含有不同濃度的PDA@Ag納米復合材料或納米銀材料)樣品的無菌濾紙片(直徑7 mm)，放置在LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h觀察結果[16]。

3) 最小抑菌濃度法(MIC，平行3組)。在無菌環(huán)境下，把滅過菌的液體培養(yǎng)基、50 μL菌懸液和不同梯度濃度的 PDA@Ag納米復合材料或納米銀材料分散在3 mL試管中，放置于滅過菌的試管中，37℃培養(yǎng)12 h[17]，觀察結果。

2 結果和討論

2.1 材料的表征

2.1.1 TEM形貌觀察

制備得到的幾種材料的TEM圖像如圖1(a)~1(e)所示。從圖1(a)可知PDA為球形，表面光滑，粒徑930±10 nm。從圖1(b~c)可見，采用原位還原法制備的PDA@Ag為核殼型結構，直徑為980±10 nm，負載厚度約25 nm；負載的銀為顆粒狀結構，且均勻地負載在PDA表面，銀的粒徑為25±5 nm，未發(fā)生明顯團聚。從圖1(d~e)可見，用化學方法制備的單質(zhì)銀粒徑為20±5 nm，此方法可通過改變NaOH的量而改變銀粒徑大小[15]；銀粒徑越小表面能越大，越易團聚，由圖可見銀明顯發(fā)生了團聚。通過對比可以確認，把納米銀負載在比表面積較大的PDA亞微球表面形成了核殼結構的PDA@Ag，既可以防止納米銀的團聚，且在使用后容易分離和再生利用。

圖1 PDA (a)、PDA@Ag (b~c)和納米銀(d~e)樣品的透射電鏡圖像Fig.1 TEM images of PDA (a), PDA@Ag (b~c) and nano-Ag (d~e) samples

2.1.2 XRD結構表征

圖 2 為 PDA(a)、Ag(b)和 PDA@Ag(c)的 XRD圖譜。圖2中PDA在2θ= 21°有明顯的衍射寬峰，對應非晶 PDA[18]。納米銀的 37.9°、44.1°、64.3°和77.2°處的衍射峰分別對應面心立方結構銀(JCPDS4-0783)的(111)、(200)、(220)和(311)衍射晶面[15]，證明化學方法合成的銀為單質(zhì)銀。PDA@Ag的圖譜中同時含有 PDA和單質(zhì)銀的衍射峰，且和非晶的PDA單質(zhì)銀的衍射峰重合；結合TEM圖像(圖1)，證明PDA@Ag核殼結構是單質(zhì)銀負載在非晶PDA表面。

圖2 PDA、Ag和PDA@Ag的XRD圖譜Fig.2 XRD patterns of PDA, Ag and PDA@Ag samples

2.1.3 X射線光電子能譜(XPS)分析

圖3為PDA@Ag的銀元素的高分辨XPS。圖3中368.27和374.22 eV出現(xiàn)的譜峰分別對應金屬銀的Ag3d5/2和Ag3d3/2的結合能，且兩峰之間差6 eV[19]，說明銀以單質(zhì)的形式存在于復合材料PDA@Ag中。在制備過程中，多巴胺首先自聚合成球狀 PDA；PDA表面暴露出的大量酚羥基和氨基通過吸附配位作用將Ag+聚集在PDA表面[20]；官能團多酚羥基在溶液介質(zhì)中具有一定的還原性，可把Ag+還原成Ag0形成O-Ag鍵而穩(wěn)定的存在PDA表面。方法將納米粒子銀負載在PDA表面，比還原劑負載法合成的復合材料結合更牢靠，也無需引入額外的還原劑，操作簡單，綠色環(huán)保。

圖3 PDA@Ag中Ag3d的XPS圖譜Fig.3 XPS spectrum of Ag3d of PDA@Ag samples

2.1.4 紫外-可見漫散射(UV-Vis DRS)光譜分析

圖4為烘干后固體樣品的UV-Vis漫散射光譜。由圖4可見，PDA沒有特征吸峰；納米銀在400~420 nm有強烈的吸收峰，410 nm處的特征吸收峰與文獻[15]報道一致，證明化學方法合成的銀為單質(zhì)；PDA@Ag在420 nm處具有強的吸收峰，和單質(zhì)銀相比峰位置發(fā)生偏移。這是因為銀負載在有機體(PDA)表面，發(fā)生等離子共振而引起紅移[21]，通過此紫外漫反射光譜也可以證明單質(zhì)銀負載在 PDA表面。

圖4 PDA@Ag中Ag3d的UV-Vis吸收光譜Fig.4 UV-Vis patterns of PDA, Ag and PDA@Ag samples

2.1.5 熱重(TGA)分析

圖5為PDA和PDA@Ag在氧氣氣氛中的TGA曲線。從圖5可以看出，PDA有機亞微球從100℃開始緩慢分解，在 300℃速率加快，表明 PDA在300℃分解加快，677℃之后保持穩(wěn)定，最終失重率為95%。PDA@Ag同樣在300℃分解速率加快，但到450℃之后就保持穩(wěn)定，失重率為 35%。2種材料的穩(wěn)定性不一致，其可能的原因為，銀通過原位還原法負載在PDA表面，部分銀可與酚羥基中的O形成Ag-O鍵而增加了材料穩(wěn)定性，具體機理有待進一步研究。

圖5 PDA和PDA@Ag的TGA曲線Fig.5 TGA curve of PDA and PDA@Ag samples

結合本節(jié)TEM、XRD、XPS和UV-Vis等表征結果，表明銀單質(zhì)負載在 PDA表面，負載率(mAg/mPDA)為60%。

2.2 抑菌性能對比

分別以S. aureus和E. coli為模式菌，用濾紙片擴散法和MIC法進行抑菌活性對比實驗。經(jīng)37℃培養(yǎng) 12 h，對比研究不同濃度的 PDA、納米銀和PDA@Ag的抑菌性能。圖6為濾紙片擴散法所得圖片，圖7為MIC法所得圖片。

圖6 不同介質(zhì)材料對S. aureus (a)和E. coli (b)抑菌實驗(37℃，12 h)濾紙片擴散照片F(xiàn)ig.6 Inhibition zones of the different dielectric materials against S. aureus (a) and E. coli (b) (37℃, 12 h) in bacteriostatic experiment

圖7 PDA@Ag對S. aureus (a)和E. coli (b)的MIC照片F(xiàn)ig.7 MIC picture of the as-synthesized PDA@Ag composites against S. aureus (a) and E. coli (b)

由圖6可知，PDA周圍沒有透明的抑菌圈，說明沒有抑菌性，在最低濃度20 mg/mL時，單質(zhì)銀和PDA@Ag對S. aureus和E. coli周圍都有透明的抑菌圈，證明單質(zhì)銀和PDA@Ag都具有抑菌活性，當增加材料濃度時，抑菌圈直徑逐漸增大，可知單質(zhì)銀和 PDA@Ag的抑菌活性隨材料濃度增大而增強。同濃度下比較材料對S. aureus和E. coli抑菌活性，銀和PDA@Ag對E. coli的抑菌圈比S. aureus的更大，說明銀和PDA@Ag對E. coli的抑菌活性更強，在相同濃度和菌種下，PDA@Ag的抑菌圈比銀更大，證明 PDA@Ag的抑菌性能比銀更強；這是由于單質(zhì)銀納米粒子在介質(zhì)中易發(fā)生團聚導致活性表面積減小，降低了單質(zhì)銀的抑菌性能。

從圖7可以看出，在PDA@Ag的濃度分別為2和1 μg/mL時，裝有S. aureus和E. coli的溶液微澄清。說明PDA@Ag對S. aureus和E. coli的最小抑菌濃度(MIC)分別約為 2和 1 μg/mL，E. coli對PDA@Ag更為敏感。這主要是因為E. coli和S.aureus的細胞壁不同，S. aureus細胞壁中含有大量的磷脂雙分子層和少量的蛋白質(zhì)，而E. coli含有少量的磷脂雙分子和大量的蛋白質(zhì)。

PDA@Ag的抑菌機理如圖 8示意。PDA@Ag在介質(zhì)中釋放出Ag+，Ag+被細菌吸附在細胞壁的表面(S. aureus和E. coli的細胞壁上的磷壁酸和脂多糖都帶負電荷)[22]。部分Ag+通過自由擴散滲透細胞壁中的磷脂雙分子層進入細菌內(nèi)部，或結合轉運蛋白和離子通道蛋白使之變性，從而讓細菌失去主動運輸營養(yǎng)或離子選擇的功能，蛋白失活而使Ag和Ag+進入細菌內(nèi)部。在滲透和結合蛋白質(zhì)過程中，Ag+很難滲透含有大量磷脂雙分子層的S. aureus，但更容易和E. coli細胞壁中大量蛋白質(zhì)中含巰基(-SH)的蛋白質(zhì)結合而使細菌細胞壁受損[23]。因此，Ag+更容易進入E. coli細菌內(nèi)部，所以對E. coli更為敏感。

圖8 PDA@Ag對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌機理Fig. 8 Antibacterial mechanism of the PDA@Ag to S. aureus and E. coli bacteria

此外，大量的Ag和Ag+進入細胞后，與細胞質(zhì)反應生成活性氧簇(ROS)，生成的ROS極其不穩(wěn)定，且具有強氧化性，可以破壞細菌合成細胞壁和細胞膜所需的蛋白質(zhì)、活性酶和呼吸鏈等，使細菌無法進行正常的新陳代謝(需氧細菌內(nèi)一般含有超氧化物歧化酶(SOD)可以清除微量自由基，但SOD中含有的半胱氨酸和Ag+發(fā)生不可逆結合使SOD失活)。當 Ag和 Ag+大量進入細菌內(nèi)部，和細菌細胞質(zhì)結合導致細菌內(nèi)外滲透壓改變，且Ag+和核酸DNA中含-SH的氨基酸反應，使細菌DNA一級結構發(fā)生改變而使細菌 DNA發(fā)生不可逆變性，影響細菌正常的轉錄和翻譯，從根本上致使細菌死亡[24]。因此納米銀對大多數(shù)細菌、真菌、放線菌和病毒都具有強的殺菌性且不會產(chǎn)生抗藥性。

3 結論

1) 制備實驗表明：以多巴胺(DPA)為原料合成聚多巴胺微球，利用其氨基和羥基將 Ag+吸附在亞微球表面，通過羥基把 Ag+還原成單質(zhì)銀原位負載在微球表面制備PDA@Ag，無需額外的還原性，綠色環(huán)保。

2) 表征結果顯示：制備的PDA@Ag為球型核殼結構，具有良好的單分散性，粒徑約為980±10 nm，厚度約為25 nm，且負載的納米銀為單質(zhì)，負載率約為60%。

3) 抑菌活性實驗結果表明：在抑菌活性實驗中可知，銀和PDA@Ag對S. aureus和E. coli都具有抑菌性，同濃度下，銀和PDA@Ag對E. coli的抑菌性更強，同菌同濃度下，PDA@Ag的抑菌性能明顯要比單質(zhì)銀的性能強。通過MIC法，進一步證明PDA@Ag對革蘭氏陰性菌E. coli更為敏感。因此，PDA@Ag具有良好的抑菌性能可應用于污水處理和醫(yī)療器械等領域。

4) 機理探討認為：PDA@Ag在溶液中會釋放Ag+，細菌細胞壁表面的負電荷可吸附Ag+，Ag+通過細胞壁進入細菌內(nèi)部破壞離子通道蛋白，與細菌細胞器中的含-SH的氨基酸結合改變蛋白質(zhì)二級結構致使其死亡，或微量的納米Ag進入細菌內(nèi)部和細胞質(zhì)作用生成活性氧簇ROS，ROS可對細菌細胞器造成根本性破壞其結果誘使細菌死亡，而PDA@Ag對E. coli抑菌性更強的原因是納米銀很難穿透含有大量磷脂雙分子層的S. aureus，但更易和含有大量蛋白質(zhì)的E. coli作用，因此其對E. coli更為敏感。