液相色譜-質(zhì)譜法分析地黃生長期中內(nèi)源性激素的變化

王少敏，張蒙蒙，郭燕子，陳麗花，劉宏民

(1.鄭州大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001；2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001)

0 引言

植物激素是一類天然存在的信號分子，在細(xì)胞分裂、分化和生長、種子休眠和萌發(fā)、植物發(fā)育、結(jié)果和衰老等方面起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)其多樣性和生物學(xué)功能，植物激素主要包括乙烯、生長素類(auxins，AXs)、細(xì)胞分裂素(cytokinins，CKs)、赤霉素類(gibberellins，GAs)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和油菜素類固醇等。盡管每類植物激素都有其特定的生物學(xué)功能，但它們通常利用協(xié)同作用或拮抗作用來共同調(diào)節(jié)植物對生物和非生物的脅迫反應(yīng)。越來越多的研究表明植物激素信號在植物生命周期中參與復(fù)雜的相互作用[1]。植物激素由于存在于復(fù)雜的生物基質(zhì)中，且濃度較低，化學(xué)性質(zhì)多樣，例如，吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)、ABA、SA和赤霉素(gibberellin，GA3)顯酸性，而玉米素(zeatin，ZT)顯堿性，這使得對它們的分析相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性，需要對不同種類的植物激素進(jìn)行快速通用的樣品預(yù)處理及分析方法的開發(fā)和驗證。目前測定植物內(nèi)源激素的方法主要有氣相色譜法(gas chromatography，GC)[2]、毛細(xì)管電泳法[3]、酶聯(lián)免疫法[4]、液相色譜法(liquid chromatography，LC)[5]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)[6]等，其中LC-MS聯(lián)用法由于具有靈敏、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，是目前植物激素檢測方法開發(fā)的方向。

地黃是一種傳統(tǒng)的玄參科中藥材，含有豐富的糖和環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，其活性成分對免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用[7-8]。關(guān)于地黃藥理、藥效和活性成分的研究已有大量報道，而關(guān)于地黃在自然生長狀態(tài)下的不同器官中獲得的植物激素的內(nèi)源性變化的研究較少。本研究旨在建立一種基于LC-MS的同時檢測地黃中5類激素中5種不同酸堿性內(nèi)源植物激素的方法，定量分析地黃生長過程中葉片和塊莖中ABA、SA、IAA和ZT含量的變化，以期增進(jìn)對植物激素作用機(jī)制的了解，并在合理范圍內(nèi)使用以提高地黃的藥用價值的研究。

1 實(shí)驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

地黃采自焦作市的試驗田，其在6月移植，10月收獲。期間分別在苗期(6月23日、7月31日)、拉線期(8月24日)、快速增長期(9月17日)、成熟期(10月12日)取樣，每次收集同一片土地上長勢相近的8個樣品。將樣品的葉和塊莖分開并用清水沖洗，然后冷凍干燥保存在-80 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)品(IAA、ZT、GA3、SA、ABA)和內(nèi)標(biāo)(苯甲酸)購自Sigma公司；甲酸(優(yōu)級純)、乙酸(優(yōu)級純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)購自Merck公司；乙酸乙酯(分析純)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。C18(Supelclean LC-18)固相萃取(solid-phase extraction，SPE)柱(500 mg，3 mL)購自Sigma公司；Oasis MAX、MCX和HLB SPE柱(60 mg，3 mL)購自Waters公司。實(shí)驗用水均為Milli-Q超純水機(jī)制備的超純水。

HPLC-MS(Waters，美國)：2695高效液相色譜儀，2996光電二極管陣列(photo-diode array，PDA)檢測器；Q-TOF MicroTM質(zhì)譜儀；MassLynx V4.1軟件系統(tǒng)。

1.2 地黃樣品的提取

將凍干的地黃樣品研磨成粉末，稱取2 g樣品用20 mL預(yù)冷的甲醇/水(體積比80∶20)在4 ℃條件下萃取12 h，在萃取之前，將內(nèi)標(biāo)(1 μg/mL的苯甲酸)添加到每個樣品中。將第一次萃取的殘余物用10 mL萃取溶劑萃取2 h，合并第一次萃取液在40 ℃旋蒸除去甲醇。之后，12 000 rpm下離心10 min，吸取上清液，用水將上清液體積調(diào)至4 mL后，加入8 mL石油醚除色素。萃取分離后，用HCl調(diào)節(jié)水相的pH值至2.5后，加入兩倍體積的乙酸乙酯超聲5 min并萃取激素。酸式提取后，用NH3·H2O將水相的pH值調(diào)節(jié)至9，重復(fù)相同的步驟，合并酯相，于40 ℃下旋蒸至干。葉片提取物用200 μL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)樣分析。塊莖提取物復(fù)溶于2 mL甲醇/水(體積比20∶80)中，然后進(jìn)行SPE純化步驟，見1.3。

1.3 SPE純化地黃塊莖提取物

C18 SPE柱純化方法：3 mL 甲醇、3 mL 水活化小柱，2 mL 80 %的甲醇溶液平衡小柱。將塊莖粗提取液用HCl調(diào)節(jié)其pH值至5.6上樣。用8 mL含0.075%的乙酸/水(體積比95∶5)的甲醇洗脫，收集洗脫液在40 ℃蒸干，200 μL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

MAX SPE柱純化方法：3 mL 甲醇、3 mL水活化小柱，直接將塊莖粗提取液上樣，用3 mL的5 mmol/L乙酸銨洗滌除雜。用4 mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脫目標(biāo)物，將洗脫液在40 ℃蒸干后于200 μL甲醇中復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜儀器分析條件

色譜柱為Agilent C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)和0.001%的甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序為0～5 min，40%～60% A；5～10 min，60% A；10～15 min，60%～80% A；15～20 min，80%～40% A。流速為1 mL/min；柱后分流比為4∶1。進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃。電離方式：ESI電離源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓2.7 kV；錐孔電壓20 V，離子源溫度80 ℃，脫溶劑氮?dú)鉁囟?80 ℃，碰撞電壓5 V，掃描范圍m/z100～500，錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速380 L/h。所選定量離子如下：ZT，m/z218；GA3，m/z345；SA，m/z137；IAA，m/z174；ABA，m/z263。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 實(shí)驗條件的優(yōu)化

2.1.1地黃塊莖粗提物的純化方法 由于地黃塊莖粗提取物中含有大量的有機(jī)物干擾植物激素的測定，為降低基質(zhì)效應(yīng)，本文比較了4種SPE小柱的純化效率。其中C18和MAX SPE柱純化方法見1.3，HLB聯(lián)合MCX柱的純化方法見文獻(xiàn)[9]，MAX聯(lián)合MCX柱的純化方法見文獻(xiàn)[10]。在樣品中分別加入混標(biāo)(0.5 μg/mL)和內(nèi)標(biāo)(0.25 μg/mL)，通過比較4種SPE方法獲得的各激素與內(nèi)標(biāo)的相對峰面積發(fā)現(xiàn)，5種植物激素的響應(yīng)信號在C18 SPE柱上得到顯著提高(表1)，因此選擇C18小柱純化樣品。

表1 植物激素在不同固相萃取小柱純化方法下的響應(yīng)值

2.1.2液相色譜洗脫條件的優(yōu)化 以甲醇(A)和水(B)作流動相，選擇不同流動相體積比對激素進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在等度洗脫條件下，激素難以分離且分離時間較長，而采用梯度洗脫，可在20 min內(nèi)完成對樣品的分離。緩沖液中酸的存在可以抑制酸性激素的解離，從而改善峰的對稱性和分離度，故選擇比較了水(B)中甲酸含量為0.001%、0.01%、0.1%時的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水中甲酸含量為0.001%時，植物激素能獲得更好的分離效果及檢測靈敏度。圖1是在1.4分析條件下得到的地黃葉片提取物中5種植物激素的LC-MS總離子流圖(total ion current，TIC)和相應(yīng)的提取離子流圖(extracted ion current，EIC)。

圖1 地黃葉提取物的LC-MS的TIC和其中5種植物激素的EIC

2.2 分析方法的評價

在優(yōu)化條件下，對該LC-MS方法的線性范圍、檢出限(limit of detection，LOD)、定量限(limit of quantitation，LOQ)、精密度和回收率進(jìn)行了驗證(表2)。用混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的濃度，由表2可見，線性相關(guān)系數(shù)在0.995 9～0.999 2之間，線性關(guān)系良好。以混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至信噪比(signal-noise ratio，S/N)為3時為檢出限，S/N=10時為定量限，得到檢出限范圍為0.013～0.038 μg/mL，定量限范圍為0.043～0.127 μg/mL。對重復(fù)性的驗證得到日內(nèi)和日間精度：日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)范圍分別是1.7%～3.2%和3.0%～10.5%(n=3)，表明該方法具有較好的可重復(fù)性。對回收率的測定分別在葉片和塊莖中進(jìn)行：取2 g植物樣品作為空白，分別加入相同體積的水(空白)和各目標(biāo)激素濃度均為1 μg/mL的混標(biāo)，經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣分析，重復(fù)3次操作，測得的樣品加標(biāo)濃度扣除空白對照濃度后，除以所加標(biāo)準(zhǔn)品濃度得到加標(biāo)回收率，所測塊莖和葉中5種植物激素的回收率范圍分別是78.4%～96.7%和81.9%～106.7%，滿足方法準(zhǔn)確性要求。

表2 植物激素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、精密度和回收率

2.3 地黃葉片和塊莖中植物激素的分析

按照1.2～1.4方法對地黃生長期中葉片和塊莖中的5種植物激素進(jìn)行了跟蹤檢測，在葉片中可檢測到全部目標(biāo)植物激素，而塊莖中未檢出GA3(推測塊莖中的GA3濃度在定量限下)，因此我們對地黃生長期中葉片和塊莖中的除GA3外的其他植物激素的濃度進(jìn)行了比較分析，結(jié)果見表3。

表3 地黃中4種內(nèi)源性激素的動態(tài)變化

生長素IAA和細(xì)胞分裂素ZT有促進(jìn)葉片生長擴(kuò)張的作用。由表3可見，地黃葉片中IAA和ZT的含量在葉片生長初期含量較低，之后二者濃度逐漸增加，在七月底和八月初達(dá)到頂峰(IAA為2.218 μg/g，ZT為1.217 μg/g)，這段時間葉莖逐漸伸長、葉片迅速擴(kuò)張，之后，其含量下降并在8月底保持在相對穩(wěn)定的水平，此時葉片生長緩慢，當(dāng)其濃度在低點(diǎn)時，葉片生長也基本停止。SA和ABA在對外界應(yīng)激中都起著重要作用[11-12]，由表3可見，從葉片成熟到脫落，葉片中ABA含量在整個生長過程中呈下降趨勢，SA的含量總體呈下降趨勢(在8月底和10月底稍有波動)，二者均在9月底達(dá)到較低水平，并保持穩(wěn)定狀態(tài)到最后。推測種子播種初期葉片中SA和ABA的含量高有利于植物對抗新生長環(huán)境的影響，因為第一次采集時間6月底正是將地黃從室內(nèi)移植到炎熱干旱的外界自然環(huán)境中時間，由于環(huán)境條件變化大，葉片中的SA和ABA的抗性在移植初期達(dá)到最高水平，之后植物葉片抗性減弱，可檢測到SA和ABA含量也在降低，到最后階段含量穩(wěn)定。

在塊莖的發(fā)育過程中IAA和ZT的濃度近似保持穩(wěn)定狀態(tài)，根系呈持續(xù)生長的狀態(tài)(表3)。ABA的濃度從苗期到拉線期均呈上升趨勢，此后逐漸下降，在最后階段保持穩(wěn)定直到果實(shí)成熟，這種行為與報道[13]中對洋姜的研究結(jié)果一致，即低ABA含量增高可能對塊莖生長有利。由此推測ABA不僅能調(diào)節(jié)對環(huán)境脅迫的反應(yīng)，還能控制莖的生長，刺激塊莖的萌發(fā)。此外，塊莖中SA和ABA的濃度在地黃生長的苗期(7月31日)到成熟期(10月12日)表現(xiàn)出相似的先增高后降低的趨勢，這表明SA和ABA對地黃塊莖的生長有著協(xié)同的作用。

植物的不同器官對激素的敏感性受多種因素的影響，如植物體內(nèi)受體的種類和含量、細(xì)胞對激素的通透性及其代謝周轉(zhuǎn)速率等。地黃塊莖中生長素IAA的濃度在4個發(fā)育時期均低于葉片中的含量，這可能是因為塊莖的發(fā)育對IAA的含量更敏感。塊莖中與植物抗性有關(guān)的ABA和SA的含量也低于葉片，這可能是因為塊莖是儲存器官，不需要參與大量的代謝活動的原因(在馬鈴薯植株中也檢測到類似的模式[14])。在地黃的整個發(fā)育期中塊莖和葉中IAA和ZT的整體含量較低，呈現(xiàn)出較小的變化，而ABA和SA的含量較高，呈現(xiàn)出顯著的變化，不僅濃度變化范圍寬，并且有相似的變化趨勢，由此可見，ABA和SA對植物抗性和塊莖形成可能有一定的協(xié)同作用。有報道表明，在使用寄生植物感染的番茄中，在宿主-寄生相互作用的初始階段，SA和ABA的含量均增加[15]，顯示出SA和ABA對生物應(yīng)激的協(xié)同抗性作用，同時也有報道SA和ABA對外界應(yīng)激(包括生物應(yīng)激和非生物應(yīng)激)表現(xiàn)出拮抗作用[16]，由此可見SA-ABA在植物中作用機(jī)制的復(fù)雜性，需要更深一步的研究。

3 結(jié)論

本文建立了一種同時分析地黃組織中的5種不同酸/堿性的內(nèi)源性植物激素(生長素、脫落酸、細(xì)胞分裂素、赤霉素和水楊酸)的LC-MS方法，對在不同的生長時期地黃葉片和塊莖中植物激素的水平進(jìn)行了檢測和差異性比較，初步分析了含量動態(tài)變化的可能成因。由于內(nèi)源激素水平可以協(xié)調(diào)內(nèi)在的發(fā)育過程并傳達(dá)環(huán)境信息，這項工作有助于理解植物激素在生理過程中的串?dāng)_，以及有助于在地黃不同發(fā)育階段，通過使用外源生長調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素的水平來影響塊莖生長、產(chǎn)量和質(zhì)量的研究。