長鏈非編碼RNA TTN-AS1靶向miR-134-5p調控乳腺癌細胞的生長和轉移*

趙振慧 李妍 李迅

(新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院·附屬腫瘤醫(yī)院乳腺內科，新疆 烏魯木齊 830011)

乳腺癌是全球威脅女性健康的一種常見惡性腫瘤，據統(tǒng)計每年死于乳腺癌的患者近49萬，在我國乳腺癌發(fā)病率較高，且一直呈上升趨勢[1]。雖然隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，乳腺癌的診斷和治療水平已經得到了顯著的提高，乳腺癌患者的生存率也相應地提高，但乳腺癌仍然是全球范圍內腫瘤患者死亡的主要原因[2-3]。乳腺癌的發(fā)病和轉移機制復雜，并且腫瘤轉移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因，因此尋找新型有效的靶點依然是乳腺癌研究的重點。隨著基因測序和基因芯片等生物技術的發(fā)展，越來越多的非編碼RNA被發(fā)現能夠參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4]，其中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。目前亦有多種LncRNA被報道在腫瘤的生長和轉移中發(fā)揮作用[5-6]。LncRNA TTN-AS1已經被研究在食管癌[7]等癌癥中調控腫瘤生長和轉移，而其對乳腺癌中的作用尚未有明確報道。本研究探討了TTN-AS1對乳腺癌的生長和轉移的作用，旨在為乳腺癌的研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺上皮細胞MCF10A(中國科學院上海生命科學研究所)，乳腺癌細胞株MCF-7、SKBR-3、 MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20(中國科學院上海生命科學研究所)，Entranster-R4000試劑(北京英格恩生物科技有限公司)，RNA轉染試劑盒(QIAGEN公司)，PrimeScriptTM 試劑盒(Takara 公司)，PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 試劑盒(Invitrogen 公司)，EvaGreen miRNA qPCR MasterMix試劑盒(Abm公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(福麥斯生物技術有限公司)，Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、Caspase-3、GAPDH一抗、山羊抗兔二抗(沈陽萬類生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) MCF10A、MDA-MB-231、BT-20、SKBR-3、MCF-7、MDA-MB-468細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞匯合率達70%～80%時使用胰蛋白酶溶液消化并傳代，取對數生長期的細胞進行后續(xù)研究。

1.3 qRT-PCR 將細胞生長匯合率達80%～90%的細胞培養(yǎng)板取出，每孔加入 1 mL Trizol 反復混勻吹打至細胞完全掉落，轉移至 RNase-free 的 1.5 mL EP 管內，按照Trizol 試劑說明書提取RNA，主要步驟為Trizol中加200 μL上述裂解液，靜置5 min，12000×g，4 ℃離心15 min，取上層溶液，加入500 μL異丙醇，12000×g，4 ℃離心10 min，棄上清，1 mL 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μL RNA-free水重懸RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量儀檢測總RNA含量。逆轉錄合成參照 Takara 公司 PrimeScriptTM 試劑盒說明書進行，反應全程冰浴操作，設置反應條件為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存反應產物用 于后續(xù)實驗操作。LncRNA的qRT-PCR 實驗操作參照 Invitrogen 公司 PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 試劑盒說明書，以GAPDH作為內參。miRNA 的qRT-PCR 實驗操作參照Abm公司的EvaGreen miRNA qPCR MasterMix試劑盒說明書，以U6作為內參。引物序列見表1。

表1 TTN-AS1、GAPDH、miR-134-5p、U6引物序列

1.4 細胞轉染 使用Entranster-R4000試劑轉染shRNA，主要步驟：將細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至細胞匯合度達50%時進行轉染，取1 μg的shRNA稀釋后終體積為25 μL，取1.5 μL的Entranster-R4000稀釋至25 μL，室溫靜置5 min，EntransterTM-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合，室溫靜置15 min，制備轉染復合物，將50 μL轉染復合物滴加到有0.45 mL全培養(yǎng)基的細胞上，前后移動培養(yǎng)皿，混合均勻，培養(yǎng)24 h后即轉染成功，進行后續(xù)實驗。根據RNA轉染試劑盒說明書轉染miRNA，具體步驟：將對數生長期的細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞匯合度達60%時進行細胞轉染，取3 μg的RNA用不含血清及雙抗的DMEM稀釋至100 μL，然后加入5 μL的RNA轉染試劑，靜置20 min后，稀釋至1 mL，并用上述混合液培養(yǎng)乳腺癌細胞8 h，然后更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.5 CCK8檢測各組的增殖能力 將細胞接種至96孔板中，每孔5×103個細胞，每組5個復孔，并設置24、48、72 h 3個時間點的時間梯度，各時間點時取出培養(yǎng)板，然后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h，然后用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度，OD值越大，細胞增殖能力越強。

1.6 細胞凋亡 根據細胞凋亡檢測試劑盒說明書，取轉染后的細胞，每孔5×103個細胞于離心管中，用500 μL的Binding Buffer重懸細胞成單細胞懸液，而后添加5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI染料，混勻后室溫避光孵育15 min，并設置Annexin V-FITC和PI單陽性管用于調熒光補償，空白管用于調電壓。使用流式細胞儀檢測上述各樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細胞凋亡數。

1.7 細胞遷移 取轉染后的各組用DMEM空培稀釋的200 μL細胞接種于Transwell小室中，每孔5×103個細胞，每組3個復孔，小室放置于24孔板中，24孔板每孔加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，并將上述24孔板轉移至細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，小室底部用PBS溶液清洗后用無水乙醇固定30 min，然后小室倒扣，底部滴加結晶紫染色10 min，清洗后晾干，于顯微鏡下觀察拍照并計數，比較各組細胞遷移數。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗 使用miRcode數據庫預測LncRNA TTN-AS1與miR-134-5p的結合位點，設計野生型和突變型的TTN-AS1 的 3′UTR-熒光素酶基因表達質粒，即WT-TTN-AS1 和 MUT-TTN-AS1，將上述質粒轉染293T細胞，然后分別將miR-134-5p mimic和miR-134-5p mimic negative control (miR-NC)分別轉染至上述細胞，根據雙熒光素酶基因報告試劑盒說明書檢測各組細胞熒光強度，實驗結果以熒光素酶活性和 Renilla 活性的比值進行統(tǒng)計學分析，實驗重復3次。

1.9 Western blot檢測各組蛋白的表達水平 取各組細胞1×106個細胞，加入200 μL RIPA蛋白裂解液和2 μL PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min后，12000×r，4 ℃離心10 min，取上清，即為細胞總蛋白。根據BCA蛋白定量試劑盒定量，定量后各組蛋白加入上樣緩沖液煮沸30 min，使蛋白樣品充分變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2 h，然后以1∶1000比例稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

2 結果

2.1 TTN-AS1高表達于乳腺癌細胞 qRT-PCR檢測結果顯示，乳腺癌細胞MDA-MB-231、BT-20、SKBR-3、MCF-7、MDA-MB-468中TTN-AS1表達水平顯著高于在乳腺上皮細胞MCF10A中的表達水平，且MDA-MB-231中表達水平最高，見圖1。提示乳腺癌細胞可能通過高表達TTN-AS1而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

圖1 TTN-AS1在乳腺癌細胞及乳腺上皮細胞中表達比較

2.2 TTN-AS1促進乳腺癌細胞增殖能力 CCK8檢測結果顯示，在轉染shRNA 24、48、72 h后，相比于sh-NC組，轉染shRNA抑制TTN-AS1表達后，乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖能力顯著下降(P<0.001)，說明TTN-AS1能夠調控乳腺癌細胞的增殖，見圖2。

圖2 CCK8檢測轉染后各組細胞增殖能力

2.3 TTN-AS1抑制乳腺癌細胞凋亡 流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，sh-TTN-AS1組細胞凋亡率顯著高于sh-NC組細胞凋亡率(P<0.001)，見圖3。說明抑制TTN-AS1表達后MDA-MB-231凋亡顯著增加，提示TTN-AS1可調控乳腺癌細胞凋亡。Western blot檢測凋亡相關蛋白表達結果顯示，相比于sh-NC組，sh-TTN-AS1組細胞抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著下降(P<0.001)，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-Caspase-3表達顯著增加(P<0.01)，見圖4。說明TTN-AS1可調控凋亡相關蛋白表達而調控乳腺癌細胞的凋亡水平。

圖3 流式細胞術檢測轉染后各組細胞的凋亡水平

圖4 Western blot檢測轉染后各組細胞凋亡相關蛋白的表達水平

2.4 TTN-AS1促進乳腺癌細胞遷移能力 Transwell小室法檢測細胞遷移能力結果顯示，與sh-NC組比較，sh-TTN-AS1組細胞遷移數顯著降低(P<0.001)，見圖5。說明抑制TTN-AS1表達可抑制MDA-MB-231細胞遷移能力。

圖5 Transwell小室法檢測轉染后各組細胞遷移能力

2.5 TTN-AS1靶向調控miR-134-5p表達 根據miRcode數據庫預測TTN-AS1的靶基因，結果顯示miR-134-5p為TTN-AS1的靶基因，其結合位點見圖6。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，WT-TTNAS1組細胞轉染miR-134-5p mimic后其相對熒光強度顯著低于轉染miR-NC組細胞(P<0.001)，而MUT-TTNAS1組細胞分別轉染miR-134-5p mimic和miR-NC后，熒光強度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖7。證明了miR-134-5p為TTN-AS1的靶基因。MDA-MB-231細胞分別轉染sh-NC和sh-TTN-AS1后，sh-TTN-AS1組細胞miR-134-5p表達水平顯著高于sh-NC組，見圖8。說明抑制TTA-AS1的表達可上調miR-134-5p的表達。

圖6 數據庫預測TTN-AS1和miR-134-5p靶向結合位點結果

圖7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測TTN-AS1與miR-134-5p靶向結合位點

圖8 qRT-PCR檢測miR-134-5p表達水平

2.6 TTN-AS1靶向miR-134-5p而調控乳腺癌細胞增殖能力 為了驗證TTN-AS1是否可以靶向miR-134-5p而調控乳腺癌細胞增殖能力，在MDA-MB-231細胞中轉染shRNA抑制TTN-AS1的表達后，轉染miR-134-5p inhibitor抑制miR-134-5p的表達，CCK8檢測細胞增殖結果顯示，抑制TTN-AS1表達后細胞增殖能力顯著降低(P<0.01)，然而抑制TTN-AS1表達的同時抑制miR-134-5p表達后細胞增殖能力顯著高于sh-TTN-AS1組細胞(P<0.001)，且與sh-NC+miR-134-5p inhibitor組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖9。說明TTN-AS1可能通過靶向miR-134-5p調控乳腺癌細胞的增殖能力。

圖9 CCK8法檢測各組細胞增殖能力

2.7 TTN-AS1靶向miR-134-5p而調控乳腺癌細胞凋亡能力 流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，轉染sh-TTN-AS1抑制TTA-AS1表達后細胞凋亡水平顯著增加(P<0.001)，而抑制TTA-AS1表達的同時抑制miR-134-5p的表達后細胞凋亡水平顯著低于僅抑制TTN-AS1組細胞凋亡水平(P<0.001)，見圖10。說明TTN-AS1可通過調控miR-134-5p而影響乳腺癌細胞的凋亡。

圖10 流式細胞術檢測轉染后各組細胞凋亡水平

2.8 TTN-AS1靶向miR-134-5p而調控乳腺癌細胞遷移能力 Transwell小室法檢測各組細胞遷移能力結果顯示，抑制TTN-AS1表達后，MDA-MB-231細胞的遷移能力顯著降低(P<0.001)，而抑制TTN-AS1表達的同時抑制miR-134-5p的表達后MDA-MB-231細胞的增殖能力顯著增加，見圖11。說明TTN-AS1可通過調控miR-134-5p的表達而調控乳腺癌細胞的遷移能力。

圖11 Transwell小室法檢測轉染后各組細胞遷移數

2.9 TTN-AS1靶向miR-134-5p而調控凋亡相關蛋白的表達 Western blot檢測結果顯示，抑制TTN-AS1表達后，MDA-MB-231細胞抑凋亡蛋白Bcl-2表達顯著減少(P<0.001)，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-Caspase-3表達顯著增加(P<0.001)，而抑制TTN-AS1的同時抑制miR-134-5p表達后，Bcl-2表達顯著增加(P<0.001)，Bax、Cleaved-Caspase-3表達顯著降低(P<0.01)，見圖12。說明TTN-AS1可通過靶向調控miR-134-5p的表達而調控細胞凋亡相關蛋白表達而促進細胞凋亡。

圖12 Western blot檢測轉染后各組細胞凋亡相關蛋白表達

3 討論

乳腺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是世界范圍內女性癌癥死亡的主要原因，乳腺癌的發(fā)病機制復雜，腫瘤轉移和腫瘤復發(fā)等問題嚴重阻礙了乳腺癌的治療，所以深入并且全面的研究乳腺癌的生長和轉移機制對于乳腺癌的治療和診斷至關重要[8-9]。近年來越來越多的研究表明LncRNA能夠調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，主要機制是LncRNA可以作為一種內源性RNA與miRNA相互作用[10]，參與靶基因的表達調控，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，例如LncRNA SNHG3已經被研究可調控乳腺癌的生長和轉移，LINC01152可調控乳腺癌的侵襲，RNA HCP5通過調控凋亡通路促進三陰性乳腺癌的發(fā)展[11-12]。TTN-AS1是近年來才被發(fā)現能夠在腫瘤中發(fā)揮調控作用的LncRNA，可調控食管癌[6]、結直腸癌[7]、骨肉瘤[13]等癌癥中發(fā)揮調控作用。

本研究發(fā)現，TTN-AS1在MDA-MB-231、BT-20、SKBR-3、MCF-7、MDA-MB-468 5種乳腺癌細胞中的表達水平均高于在乳腺上皮細胞中的表達水平，在MDA-MB-231細胞中的表達水平最高。向MDA-MB-231細胞中轉染shRNA抑制TTN-AS1的表達，發(fā)現抑制TTN-AS1的表達后細胞增殖和遷移能力顯著下降，細胞凋亡水平顯著增加，并且抑制凋亡的蛋白Bcl-2表達水平顯著下調，而促進凋亡的Bax和Cleaved-Caspase-3的表達顯著增加。提示TTN-AS1可調控乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，并且通過調控凋亡相關蛋白的表達而調控乳腺癌細胞的凋亡水平。

LncRNA是人類基因組中一類重要的表觀遺傳調控因子，以RNA的形式進行表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控等多層面調控基因的表達[14-16]；其中，LncRNA與miRNA相互調控，進而調控體內多種生理進程，其對miRNA的調控機制有多種，其中最常見的調控形式為與miRNA結合，抑制miRNA的表達進而影響miRNA與其靶基因mRNA的結合，影響靶基因的翻譯[17-18]。本研究通過miRcode數據庫預測并且通過雙熒光素酶基因報告實驗驗證了miR-134-5p為TTN-AS1的靶基因，并且抑制TTN-AS1的表達后miR-134-5p的表達亦顯著增加，說明miR-134-5p為TTN -AS1的靶基因，并且LncRNA TTN-AS1能夠靶向抑制miR-134-5p的表達。

為了驗證TTN-AS1是否通過調控miR-134-5p的表達而調控乳腺癌的生長和轉移，本文在轉染shRNA抑制TTN-AS1的表達的同時轉染miR-134-5p inhibitor而抑制miR-134-5p的表達，檢測發(fā)現細胞增殖和遷移能力均顯著高于單獨抑制TTN-AS1組細胞的增殖和遷移能力，細胞凋亡水平顯著低于單獨抑制TTN-AS1組，并且凋亡相關蛋白的表達與單獨抑制組相比均有顯著差異，說明TTN-AS1是通過靶向抑制miR-134-5p的表達進而促進乳腺癌細胞的生長和轉移能力。

4 結論

長鏈非編碼RNA TTN-AS1高表達于乳腺癌細胞，并且能夠促進乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，抑制細胞凋亡水平，但其深入的調控機制還需進一步探究。