EP4/PI3K p110γ 信號(hào)通路在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其意義

韋曉虹，劉雪婷，胡芳，梁藹明，孫遼＊

（1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 內(nèi)分泌與代謝病科，廣東 珠海 519000；2.深圳市第二人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，廣東 深圳 518000）

0 引言

甲狀腺癌是我國增長最快的內(nèi)分泌惡性腫瘤[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）約占79%～94%，多數(shù)對(duì)傳統(tǒng)治療（手術(shù)、放射性碘、TSH抑制）效果和預(yù)后良好，但仍有5%～20%患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，目前尚無有效治療手段[2]。我們前期發(fā)現(xiàn)前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）在PTC中合成增加，且只有PGE2 受體4（Prostaglandin E2 receptor 4，EP4）在腫瘤組織中高表達(dá)，提示PGE2可能主要通過EP4介導(dǎo)在PTC中的作用[3]。本研究通過分析人PTC中EP4下游主要信號(hào)分子PI3K的表達(dá)，初步探討EP4/PI3K信號(hào)通路在PTC發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例和標(biāo)本。留取2013年8月至2014年9月中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院普外科甲狀腺結(jié)節(jié)全切或次全切除的甲狀腺組織。選取病理確認(rèn)的甲狀腺乳頭狀癌組織（PTC）及癌旁組織（ANT）、結(jié)節(jié)性甲狀腺組織（NG）各30例。新鮮甲狀腺組織用于RT-qPCR檢測，石蠟標(biāo)本用于免疫組化。所有病例術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 主要試劑。RT-qPCR引物設(shè)計(jì)和合成（Invitrogen，美國）；TRIzol RNA提取試劑盒（Invitrogen，美國）；PrimeScript RT Reagent Kit Perfect Real Time試劑盒（TaKaRa，日本）；免疫組化二抗試劑盒（Thermo Scientific）；EP4多克隆抗體（Cayman，美國）；PI3K p110γ多克隆抗體（Abcam，美國）。

1.3 RT-qPCR。使用Trizol溶液研磨新鮮甲狀腺組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 min，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共循環(huán)40次，95℃反應(yīng)5 s，65℃反應(yīng)1 min。使用β-actin作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt公式進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，每個(gè)樣本分別作3次重復(fù)。

1.4 免疫組化。4μm厚石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，檸檬酸溶液（pH=6.0）微波爐抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，一抗4℃孵過夜，二抗孵育后DAB顯色，蘇木素染核，PBS返藍(lán)，中性樹膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，陽性對(duì)照選結(jié)腸癌組織切片。Zeiss正置熒光顯微鏡觀察結(jié)果并用彩色CCD數(shù)碼相機(jī)拍照，每張切片隨機(jī)選5個(gè)區(qū)域，放大倍數(shù)選200×。結(jié)合染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分率判定免疫組化結(jié)果[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用T檢驗(yàn)和方差分析；數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布時(shí)用“中位數(shù)（四分位間距）”表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料。PTC組女19例，男11例，年齡為13～81歲，平均38歲；NG組女21例，男9例，年齡為15～75歲，平均37歲。性別構(gòu)成及年齡在兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 EP4在PTC組織中表達(dá)增加。PTC組EP4 mRNA表達(dá)水平明顯高于ANT（P=0.015）和NG組（P=0.035），見圖1A。EP4在胞質(zhì)和胞核均有表達(dá)，PTC組中表達(dá)明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A、2C、2E。

圖1 RT-PCR檢測EP4、PI3K p110α和p110γ mRNA表達(dá)水平

2.3 PI3K p110γ在PTC組織中表達(dá)增加。我們檢測了PI3K p110α、p110γ的mRNA表達(dá)水平。PTC組PI3K p110γ mRNA表達(dá)明顯高于ANT（P＜0.001）和NG組（P=0.002），而PI3Kp110α mRNA表達(dá)水平在三組間無差別，見圖1B、1C。PI3K p110γ蛋白在PTC組中表達(dá)明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B、2D、2F。

圖2 免疫組化檢測EP4和PI3K p110γ蛋白表達(dá)情況

3 討論

本研究結(jié)果顯示EP4 mRNA和蛋白水平在PTC中表達(dá)均明顯增加。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)人PTC組織中PGE2合成增加，EP4抑制劑可以抑制PTC腫瘤細(xì)胞生長，提示PGE2主要通過EP4介導(dǎo)在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用。EP4屬于G蛋白偶聯(lián)受體，不僅與Gs偶聯(lián)激活cAMP/PKA信號(hào)通路，還可與Gi偶聯(lián)激活PI3K信號(hào)通路[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)EP4/PI3K信號(hào)通路參與腫瘤的細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等過程[6]，但在PTC發(fā)病中的作用尚不清楚。

PI3K可分為3類，其中Ⅰ類研究最廣泛[7-8]。I類PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110（α，β，δ，γ）組成，其中編碼p110α的PIK3CA基因與腫瘤發(fā)病最為密切。我們結(jié)果顯示PI3K p110γ mRNA和蛋白在PTC中高表達(dá)，而p110α在三種組織中表達(dá)無明顯差異。既往研究發(fā)現(xiàn)：PI3K p110γ通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄編程過程，介導(dǎo)胰腺導(dǎo)管癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。但在PTC中，EP4如何通過激活PI3K介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮作用，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所訴，EP4/PI3K p110γ信號(hào)通路可能參與了PTC的發(fā)病。