儲糧真菌自動檢測儀的研究與開發(fā)

張海洋，田 琳，祁智慧，唐 芳?

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

目前，真菌危害仍是影響儲糧安全的重要因素之一[1-3]。例如：真菌生命代謝活動會產(chǎn)生熱量，引起儲糧害蟲生命活動[4]；真菌的生長會導致糧食發(fā)芽率降低[5-6]；真菌在糧食中大量繁殖會產(chǎn)生霉味，使糧食變色，從而使儲糧品質(zhì)下降[7-8]；產(chǎn)毒真菌在糧食中繁殖產(chǎn)生的真菌毒素更是嚴重影響糧食的食品衛(wèi)生安全[9-10]。

儲糧中常見的真菌主要是曲霉屬和青霉屬真菌[11-12]，通過肉眼很難對其侵染情況進行定量測算。傳統(tǒng)的儲糧微生物檢測方法是平板菌落計數(shù)法[13]，將單個細胞或孢子培養(yǎng)成肉眼可見的菌落，通過統(tǒng)計菌落數(shù)計算樣品帶菌量，進而評價微生物污染程度，但該方法檢測時間長，菌落培養(yǎng)需5～7 d，且對檢驗人員的專業(yè)技能及實驗條件要求較高，糧食行業(yè)實際操作難度較大[14-16]。目前我國糧食行業(yè)通過對糧堆溫度檢測來實現(xiàn)儲糧霉變發(fā)熱的防控[17-19]，溫度檢測存在嚴重滯后，當溫度異常升高時，糧堆微生物已經(jīng)開始大量繁殖，嚴重影響糧食品質(zhì)。本項目研發(fā)團隊經(jīng)過多年研究，基于傳統(tǒng)的微生物菌落計數(shù)法，建立了一個儲糧微生物早期快速檢測方法—孢子計數(shù)法[20]，并于 2018年 3月上升為行業(yè)標準頒布實施[21]。孢子計數(shù)法省略菌落培養(yǎng)過程，以顯微放大技術(shù)直接對樣品上洗脫的孢子進行觀察計數(shù)，簡化實驗條件，縮短檢測時間。但顯微鏡操作及真菌孢子識別需一定微生物學基礎(chǔ)，對于基層糧庫保管人員仍具有一定難度，基于上述原因，團隊研發(fā)了儲糧真菌自動檢測儀。該儀器采用自動位移對焦算法[22-23]以及圖像識別技術(shù)，對孢子計數(shù)法中涉及的顯微鏡操作和真菌孢子識別實現(xiàn)儀器自動化，降低人員操作難度和誤差，便于檢測方法標準的推廣應用，盡早服務于儲糧行業(yè)霉變發(fā)熱的早期預警。

1 儲糧真菌檢測方法的原理及操作

糧食儲藏過程中，主要儲糧真菌的生長伴隨著真菌孢子的產(chǎn)生，孢子數(shù)量與儲糧真菌滋生顯著相關(guān)，通過檢測真菌孢子數(shù)量的變化，可對儲糧真菌生長情況進行判定。孢子計數(shù)法的檢測結(jié)果與平板菌落計數(shù)法具有很好的相關(guān)性[20]。具體操作方法為，稱取一定數(shù)量的糧食樣品，加水劇烈振蕩，洗脫糧食表面生長的真菌孢子，洗脫液經(jīng)過濾后加入計數(shù)板中，置于顯微鏡下，對洗脫的孢子進行識別計數(shù)。操作細節(jié)要求可參見行業(yè)標準[21]，操作流程如圖1。

圖1 真菌孢子計數(shù)法操作流程Fig.1 Operation process of fungal spore counting method

由操作流程圖可看出，樣品的前處理振蕩洗脫操作簡單，但顯微成像技術(shù)需要一定的微生物學基礎(chǔ)?；鶎訖z測人員在使用該方法時，由于大部分檢測人員不具備微生物學基礎(chǔ)，對于顯微鏡的成像調(diào)試操作以及儲糧真菌孢子的識別存在很大問題，導致檢測結(jié)果不準確。因此，本研究考慮將顯微鏡成像操作及真菌孢子識別實現(xiàn)自動化和智能化，以降低基層糧庫檢驗人員的操作難度，減少真菌孢子識別錯誤導致的檢測誤差。

2 儲糧真菌自動檢測儀設(shè)計方案

儲糧真菌自動檢測儀主要實現(xiàn)糧食上洗脫的真菌孢子在顯微鏡下能夠自動對焦拍照、自動識別計數(shù)及結(jié)果輸出。自動檢測儀由顯微成像硬件、圖像識別軟件和中控軟件三部分組成。儀器總體設(shè)計框架如圖2。

圖2 儀器整體設(shè)計框架Fig.2 The overall design framework of the instrument

檢測人員按照行標LS/T 6132《糧油檢驗糧食真菌檢測方法孢子計數(shù)法》要求對糧食樣品進行前處理，將洗脫液滴入計數(shù)板后送入真菌自動檢測儀靜置待檢。顯微鏡成像硬件，首先將計數(shù)板自動送入待檢區(qū)，用圖像清晰度算法對孢子計數(shù)區(qū)進行自動對焦和顯微成像，當顯微視野下呈現(xiàn)真菌孢子清晰界面時進行自動拍照，并將照片發(fā)送給中控軟件。圖像識別軟件，接收中控軟件發(fā)送來的圖片，調(diào)用神經(jīng)網(wǎng)絡圖像識別算法對照片中真菌孢子進行自動識別、標記并計數(shù)，標記后的圖片和計數(shù)結(jié)果一起發(fā)送給中控軟件。中控軟件作為人機交互軟件，可對接和控制顯微成像硬件及圖像識別軟件，將識別及判定結(jié)果向操作人員進行可視化輸出。

3 顯微自動成像硬件

3.1 硬件結(jié)構(gòu)組成

顯微自動成像硬件主要由控制主板、顯微自動對焦系統(tǒng)及自動位移臺組成，如圖3所示。

圖3 顯微自動成像硬件結(jié)構(gòu)Fig.3 Hardware structure of automatic microscopic imaging

控制主板實現(xiàn)對自動位移及自動對焦成像系統(tǒng)的控制，由主控芯片和步進電機驅(qū)動芯片組成。自動位移臺是通過步進電機控制樣品臺在XY軸移動，將計數(shù)板送入自動識別區(qū)，減少了檢測人員尋找計數(shù)區(qū)的操作。自動對焦系統(tǒng)是Z軸方向通過對不同焦距的圖像進行清晰度評價，找到目標真菌孢子最佳焦距，從而拍攝出可供識別的清晰孢子圖像，解決人為視覺誤差導致對焦效果不一致的問題。

3.2 自動對焦成像算法及效果評價

自動對焦成像效果是實現(xiàn)儲糧真菌自動檢測的關(guān)鍵第一步。真菌孢子體積非常小，有些真菌孢子直徑只有2～3 μm[24]，要求自動對焦算法的誤差也必須控制在2～3 μm，如果對焦誤差超出有效焦距范圍，即會出現(xiàn)成像模糊現(xiàn)象，無法達到自動成像拍照的目的。

自動對焦成像主要通過對焦算法實現(xiàn)。我們選擇了顯微成像四種常用對焦算法進行測試和評價，四種算法包括：Brenner梯度函數(shù)、Tenengard梯度函數(shù)、Laplacian梯度函數(shù)、Variance方差。采用物鏡從不同高度返回對焦點的偏差，對四種對焦算法自動對焦效果進行評價，即將清晰對焦面設(shè)置為檢測原點，手動調(diào)節(jié)物鏡至不同高度來測試算法返回原點的能力，測試結(jié)果如表 1，對焦離散偏差如圖4。

表1 不同算法對焦偏差比較Table 1 Comparison of focus deviation of different algorithms μm

圖4 不同算法對焦離散偏差Fig.4 Focus discretization deviation of different algorithms

由表1和圖4可知，Brenner算法的對焦高度平均偏差和對焦離散偏差最小，明顯優(yōu)于其它三個算法。Bernner函數(shù)原理為計算相鄰兩個像素灰度差的平方，計算簡單，計算量小，更適用于真菌孢子小目標的對焦計算。

4 真菌孢子圖像識別軟件

4.1 構(gòu)建真菌孢子圖庫

構(gòu)建具有足夠代表性的儲糧真菌孢子圖庫是真菌孢子圖像識別的基礎(chǔ)。實驗室選擇儲糧常見危害真菌，挑取純種培養(yǎng)菌株與實際糧食樣品洗脫物混合，顯微鏡下拍照，人工識別區(qū)分真菌孢子與糧食雜質(zhì)并做標記，為識別模型的構(gòu)建提供大量的訓練集圖片。實驗室已訓練的菌種包含阿姆斯特丹曲霉、擬灰綠曲霉、皮落靑霉、黃曲霉、黑曲霉等十余個純種菌株。后期增加了實際糧食樣品洗脫真菌孢子圖片，已拍攝照片2 000余張，訓練儲糧真菌孢子樣本1萬余個。

4.2 真菌孢子圖像識別算法

真菌孢子識別效果是實現(xiàn)儲糧真菌自動檢測的核心，需要借助于圖像識別技術(shù)實現(xiàn)，本儀器采用了卷積神經(jīng)網(wǎng)絡圖像識別算法，是與北京郵電大學合作共同研究完成，該算法具有預處理簡單，識別準確率高的優(yōu)點[22]。

該算法主要由 RPN區(qū)域候選網(wǎng)絡和 Faster R-CNN目標檢測組成，F(xiàn)aster R-CNN提起候選圖像特征圖，RPN區(qū)域候選網(wǎng)絡生成區(qū)域候選框，F(xiàn)aster R-CNN基于RPN提取的候選框檢測并識別候選區(qū)域中的目標。其識別流程為：真菌孢子圖像輸入卷積神經(jīng)網(wǎng)絡算法，提取圖像特征，生成區(qū)域候選框、對孢子特征圖及區(qū)域候選框進行分類回歸，輸出得到真菌孢子標記圖像。識別流程和標記圖像輸出如圖5和圖6。

圖5 卷積神經(jīng)網(wǎng)絡識別示意圖Fig.5 Schematic diagram of convolution neural network image recognition

圖6 真菌孢子識別標記圖像Fig.6 Marking image of fungal spore identification

4.3 真菌孢子圖像識別效果評價

對已訓練過擬灰綠曲霉、皮落青霉、白曲霉進行識別準確率測試，測試單一菌種的識別準確率，并對吉林染菌糧食樣品孢子洗脫液進行識別，測試結(jié)果如表2。

表2 真菌孢子圖像識別測試Table 2 Recognition test of fungal spore image

識別軟件對于已訓練過的菌種孢子的識別準確率能達到90%以上，但是對于實際染菌糧食樣品洗脫的真菌孢子識別準確率為 78.0%，造成識別準確率降低的原因主要有兩點，一是染菌糧食樣品上的真菌孢子與實驗室純種培養(yǎng)的真菌孢子在直徑和形態(tài)上存在一定差異；二是真菌孢子形態(tài)上非常接近，在菌種分類上存在一定誤差。針對上述問題，我們增加了實際染菌糧食上洗脫孢子的圖片進行訓練，另一方面，真菌污染等級是按照真菌總數(shù)進行劃分，真菌種類有參考價值，但不是等級劃分的必要條件，因此識別結(jié)果只做孢子標記，不做種類標記，以總菌數(shù)計算。

增加吉林糧食樣品洗脫孢子進行訓練，訓練樣本5 000余個，訓練結(jié)束后，分別對吉林、寧夏、長沙樣品進行圖像識別，結(jié)果見表3。

表3 補充樣本后孢子識別準確率Table 3 Spore identification accuracy rate after replenishing the sample

增加實際儲糧樣本后，識別準確率有了顯著提升，對于其它地區(qū)儲糧真菌孢子識別準確率可達到80%以上。由此可見，可通過后續(xù)擴充實際儲糧的樣品進行訓練，不斷提高識別準確率。

5 中控軟件設(shè)計

中控軟件作為人機交互軟件，對接顯微成像硬件及圖像識別軟件，并將孢子識別及判定結(jié)果向操作人員進行可視化輸出。人機交互界面分為控制區(qū)、視野區(qū)和統(tǒng)計區(qū)。控制區(qū)為備檢樣品選擇操作區(qū)。選擇檢測區(qū)后，啟動檢測程序，顯微成像控制硬件將相應檢測區(qū)移動至物鏡下，進行自動對焦、拍攝及識別。視野區(qū)為孢子圖像展示區(qū)。圖像識別軟件對真菌孢子圖像識別完畢后，識別縮略圖平鋪于視野區(qū)，打開其任意一張縮略圖后，可看到該張圖片的具體識別標記結(jié)果。統(tǒng)計區(qū)為最終結(jié)果顯示區(qū)。識別軟件對檢測區(qū)圖像識別完畢后，中控軟件根據(jù)真菌孢子識別計數(shù)結(jié)果，進行儲糧真菌生長程度判定，并將孢子計數(shù)結(jié)果及真菌生長等級呈現(xiàn)給用戶。中控軟件界面設(shè)計如圖7。

圖7 中控軟件界面Fig.7 Interface of central control software

6 結(jié)論

本研究采用神經(jīng)網(wǎng)絡圖像識別技術(shù)和自動位移對焦算法，將LS/T 6132《糧油檢驗糧食真菌檢測方法孢子計數(shù)法》行業(yè)標準中涉及專業(yè)技能操作的環(huán)節(jié)實現(xiàn)智能化和自動化，研發(fā)了儲糧真菌自動檢測儀。該儀器通過設(shè)計自動位移對焦系統(tǒng)，自動對焦偏差小于真菌孢子圖像清晰呈現(xiàn)有效焦距范圍，可實現(xiàn)儲糧真菌孢子的自動對焦成像并拍照；首次采用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡算法實現(xiàn)儲糧真菌孢子圖像的自動識別，對純種培養(yǎng)的真菌孢子識別準確率可達90%以上，對于實際糧食樣品上洗脫的真菌孢子識別準確率可達到80%以上，通過擴大實際污染糧食上孢子樣本的訓練集，可進一步提高識別的準確率。儲糧真菌自動檢測儀操作簡便、快速、準確率高，可大幅降低檢測人員操作難度和誤差，在基層糧庫和質(zhì)檢部門適用性強，便于儲糧真菌檢測方法標準的推廣應用。

本項目研發(fā)團隊將繼續(xù)增加孢子圖庫中的訓練集圖片，將鐮刀菌屬物種、鏈格孢屬物種及其它常見的產(chǎn)毒真菌引入，作為訓練的菌種。擴大識別軟件的識別范圍，提高識別的準確率。早日實現(xiàn)糧食中危害真菌的早期快速檢測，為及時、有效防控真菌污染提供技術(shù)支持，最終實現(xiàn)服務于糧食行業(yè)，保障國家糧食安全的目標。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。