巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和突起萎縮的抑制作用

楊志友，馬智慧，張永平，宋 采，胡雪瓊

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室//廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心//水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連，116034）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種長(zhǎng)期進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病。目前我國(guó)約有1 000 萬阿爾茨海默病患者，居世界首位，同時(shí)我國(guó)也是全球新發(fā)病例增速最快的國(guó)家之一?，F(xiàn)在臨床上用于治療阿爾茨海默病的藥物如膽堿酯酶抑制劑rivastigmine 和NMDA 受體抑制劑memantine屬于對(duì)癥療法，并不足以改善患者的記憶功能，且伴隨著嚴(yán)重的副作用[1-2]。Aβ 老人斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)是阿爾茨海默病的兩大病理學(xué)特征[3]，Aβ 級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為神經(jīng)突起萎縮和突觸丟失處于神經(jīng)細(xì)胞死亡的上游并構(gòu)成了AD 的病理學(xué)基礎(chǔ)[4]。以Aβ和Tau 蛋白為作用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的藥物Solanezumab[5]和TauRx0237[6]均在三期臨床中以失敗告終，這說明疾病的發(fā)生機(jī)制與藥物的治療作用機(jī)制可能是以不同的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。有研究表明，Aβ 會(huì)誘導(dǎo)突觸丟失和軸突萎縮[7]，而軸突萎縮在阿爾茨海默病中啟動(dòng)并加速腦神經(jīng)元細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的破壞和記憶丟失[8]。因此，促進(jìn)突起再生和保護(hù)神經(jīng)元進(jìn)而重建受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可能是AD 記憶修復(fù)的關(guān)鍵。

藻類是海洋生物活性物質(zhì)的重要來源，目前已發(fā)現(xiàn)的海洋生物活性物質(zhì)中約40%來自藻類[9]。海帶（Laminaria japonica）是一種常用的藥食同源藻類，其主要活性成分是海帶巖藻多糖（Fucoidan）。海帶巖藻多糖是一種富含巖藻糖的硫酸鹽聚合物，具有廣泛的藥理學(xué)作用，如抗衰老[9]、抗炎癥性腸病[10]、抗腫瘤[11]、提高免疫[12]、抗病毒[13]、改善Aβ1-40 誘導(dǎo)的記憶損傷[14]等，然而，是否具有改善Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷和神經(jīng)突起再生的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究從巖藻多糖抗神經(jīng)損傷的角度出發(fā)，探討其對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的保護(hù)和突起再生的作用，以期為其對(duì)AD 的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也可為海藻來源多糖的藥物研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑與細(xì)胞株 巖藻多糖（Fucoidan）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（S11142），SH-SY5Y 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫，胎牛血清 FBS（10270-106 ）、MEM 培養(yǎng)基（C11095500BT）、F12 培養(yǎng)基（C11765500BT）、DNase I/Trypsine抑制劑（18047-019 和17075-011）、0.05% 和 0.25% Trypsin-EDTA（25300-054 和25200-072）、馬血清（26050-088）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。一次抗體β3-tubulin（sc-80005）購(gòu)于SantaCruz公司，一次抗體MAP2 和熒光488/594 nm 標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二次抗體購(gòu)于Abcam 公司。

1.1.2儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，Bioteck 儀器公司；倒置熒光顯微鏡，OLYMPUS IX73；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Crystal 公司。

1.2 方法

1.2.1SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)采用MEM/F12 培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)15% FBS，100 U/L青霉素和100 μg/L 鏈霉素），于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元培養(yǎng) 胎鼠大腦皮層中神經(jīng)元的分離方法參照前期研究[15]。簡(jiǎn)述如下，取懷孕14 d 的ICR 胎鼠大腦皮層，去掉硬腦膜，剪碎，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的Trypsin-EDTA 于37 ℃消化15 min，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%葡萄糖、體積分?jǐn)?shù)12%馬血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal 培養(yǎng)基（HS 培養(yǎng)基）終止消化，然后加入600 U/mL DNase I 和0.3 mg/mL 的Trypsine 抑制劑，37 ℃孵育15 min，加入HS 培養(yǎng)基后，離心（90 g，3 min）去上清，用CMF-HBSS 緩沖液重懸、離心兩次，將細(xì)胞重懸于HS 培養(yǎng)基中，過孔徑0.45 μm 濾膜，將細(xì)胞接種于8 孔板中。

1.2.3巖藻多糖對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞毒性作用檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Cont）和巖藻多糖組（0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL 和1、5、10、20、30 mg/mL）。將SH-SY5Y 細(xì)胞接種于96 孔板中（5 × 104mL-1，100 μL），每組6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，用全反式維甲酸（RA）誘導(dǎo)神經(jīng)分化6 d 后，加入0.1～ 30 000 μg/mL 的巖藻多糖，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK8（APExBIO，K1018）試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)定光密度值。

1.2.4巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 致SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的作用 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Cont）、模型組（Aβ25-35 20 μmol/L）和巖藻多糖組（0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL）。將SH-SY5Y 細(xì)胞接種于96 孔板中（5 × 104mL-1，100 μL），每組6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，用全反式維甲酸（RA）誘導(dǎo)神經(jīng)分化6 d 后，加入0.1～ 1 000 μg/mL 的巖藻多糖，1 h 后，每孔加入2 μL Aβ25-35（1 mmol/L）至終濃度為 20 μmol/L，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，CCK8 法測(cè)定450 nm處光密度值。

1.2.5巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 致原代小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用 實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組（Cont）、模型組（Aβ25-35 10 μmol/L）和巖藻多糖組（0.01、0.10、0.50、1.00 mg/mL）。將原代皮層神經(jīng)細(xì)胞接種于96 孔板（2 × 105mL-1，100 μL）中，每組5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3 d 后，加入0.01～ 1.00 mg/mL 的巖藻多糖，1 h 后，加入Aβ25-35（10 μmol/L）處理24 h 后，用CCK8 法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.6巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 致皮層神經(jīng)突起萎縮的作用 原代皮層神經(jīng)細(xì)胞接種于8 孔板（5 × 104mL-1，400 μL）中，培養(yǎng)3 d 后，加入不同質(zhì)量濃度的巖藻多糖（0.1 和1.0 mg/mL），1 h 后，加入Aβ25-35（10 μmol/L），共培養(yǎng)3 d 后，棄去上清，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 多聚甲醛（PFA）固定1 h，加入一次抗體β3-tubulin（突起染色）和MAP2（神經(jīng)元胞體和樹突染色）于4 ℃孵育12 h，然后加入激發(fā)波長(zhǎng)594/488 nm 熒光探針標(biāo)記的山羊抗鼠/兔二次抗體，DAPI 用于細(xì)胞核的染色。使用倒置熒光顯微鏡拍攝照片，每組拍攝10 張，用ImageJ（NIH）軟件分析β3-tubulin 和MAP2 染色陽性的神經(jīng)突起密度。

1.2.7巖藻多糖對(duì)正常皮層神經(jīng)突起再生的作用 原代皮層神經(jīng)細(xì)胞接種于8 孔板（4 × 104mL-1，400 μL）中，培養(yǎng)2 d 后，加入不同質(zhì)量濃度的巖藻多糖（0.1和1.0 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 d，棄上清，分別用β3-tubulin 和MAP2 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，DAPI 用于細(xì)胞核染色。用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)分析神經(jīng)突起密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±SEM 表示。用ImageJ、GraphPad Prism 5.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并制圖。對(duì)于不符合正態(tài)分布的細(xì)胞存活率結(jié)果（圖1-3），進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后[16]，用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P <0.05 被認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻多糖對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞毒性作用

圖1 中，與對(duì)照組（Cont）相比，加入0.1～ 1 000 μg/mL 巖藻多糖組SH-SY5Y 細(xì)胞存活率無明顯變化（P >0.05），隨著巖藻多糖濃度的升高，5～30 mg/mL 巖藻多糖組顯著降低SH-SY5Y 細(xì)胞存活率（P <0.05），說明高濃度巖藻多糖對(duì)細(xì)胞有一定毒性，因此選擇0.1～ 1000.0 μg/mL 巖藻多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 巖藻多糖對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的作用Fig.1 The effect of Fucoidan on SH-SY5Y cell survival rate

2.2 巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 致SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

前期研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L 的Aβ25-35 作用24 h可顯著降低 SH-SY5Y 細(xì)胞存活率[17]，因此，SH-SY5Y 細(xì)胞系A(chǔ)D 模型用20 μmol/L Aβ25-35。0.1～1 000.0 μg/mL 巖藻多糖作用于細(xì)胞1 h 后，加入Aβ25-35 處理24 h。與對(duì)照組（Cont）相比，模型組（Veh）細(xì)胞存活率顯著降低（P <0.001），而與模型組相比，巖藻多糖10～ 1 000 μg/mL 組細(xì)胞存活率顯著升高（P <0.05），且有濃度依賴性。表明巖藻多糖可抑制Aβ25-35 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷（圖2）。

圖2 巖藻多糖抑制Aβ25-35 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡Fig.2 Fucoidan inhibits Aβ25-35 induced SH-SY5Y cell apoptosis

2.3 巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 致小鼠原代皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[15]，10 μmol/L 的Aβ25-35 作用于神經(jīng)元3 d 后，細(xì)胞存活率顯著降低，與對(duì)照組相比差異顯著（P <0.05）。巖藻多糖預(yù)處理1 h 后與Aβ25-35 共培養(yǎng)3 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1、0.5 和1.0 mg/mL 的巖藻多糖組細(xì)胞存活率明顯升高（P <0.01），表明巖藻多糖能夠抑制Aβ25-35 誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元損傷（圖3）。

2.4 巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 致小鼠原代皮層神經(jīng)元突起萎縮的抑制作用

通過構(gòu)建Aβ25-35 誘導(dǎo)的神經(jīng)元突起萎縮模型，探討巖藻多糖對(duì)神經(jīng)突起萎縮的抑制作用，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（Cont）相比，10 μmol/L 的 Aβ25-35 顯著降低 β3-微管蛋白（β3-tubulin）陽性的突起密度（P <0.001）。與模型組（Veh）相比，0.1 和1 mg/mL 的巖藻多糖組均能顯著增加突起密度（P <0.001），表明巖藻多糖可以抑制Aβ25-35 誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元突起萎縮。

圖4 巖藻多糖改善Aβ25-35 誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元突起萎縮Fig.4 Fucoidan ameliorates Aβ25-35 induced primary cortical neurites atrophy

續(xù)圖4（Continued）

2.5 巖藻多糖對(duì)正常原代皮層神經(jīng)元突起再生的作用

為探討巖藻多糖改善Aβ25-35 誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元突起萎縮的作用是源于對(duì)Aβ 的抑制作用還是對(duì)神經(jīng)元突起的再生作用，測(cè)定巖藻多糖對(duì)正常培養(yǎng)的神經(jīng)元突起再生的作用（圖5）。免疫熒光染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，巖藻多糖0.1 和1.0 mg/mL 組能顯著增加β3-tubulin 陽性染色的突起密度（P <0.01）。結(jié)果說明巖藻多糖具有促進(jìn)神經(jīng)元突起再生的作用。

圖5 巖藻多糖對(duì)正常培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元突起的再生作用Fig.5 Effect of Fucoidan on normal cultured primary cortical neurites regrowth

3 討論

Aβ 老人斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)是AD 的兩大病理性特征。有研究表明，Aβ 寡聚體能夠加速Tau蛋白的磷酸化，促進(jìn)神經(jīng)突起解聚和萎縮，增大鈣離子內(nèi)流，最終促進(jìn)神經(jīng)元的死亡[7]。神經(jīng)元的大量死亡造成神經(jīng)元之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)結(jié)破壞，信息在神經(jīng)元間的傳遞終止，造成大腦對(duì)信息存儲(chǔ)、保持和再現(xiàn)功能破壞，從而導(dǎo)致記憶損傷[8]。因此，通過促進(jìn)萎縮的神經(jīng)元突起再生，進(jìn)一步整合到已有的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)可能是改善記憶的關(guān)鍵。本課題組前期研究結(jié)果也表明，一些促進(jìn)軸突或樹突再生的化合物能夠明顯增強(qiáng)正常小鼠的認(rèn)知和空間記憶能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖能夠顯著抑制Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，表明其具有很好的神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，巖藻多糖能夠促進(jìn)正常神經(jīng)元突起的再生，提示其改善記憶的作用也可能是通過重新構(gòu)建破環(huán)的神經(jīng)元局部回路與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。

海帶中巖藻多糖一般為硫酸酯化多糖，分子質(zhì)量和極性都相對(duì)較大，血腦屏障的透過性是保證其直接作用于大腦神經(jīng)元的關(guān)鍵。有研究表明[18]，利用平行人工膜滲透試驗(yàn)（PAMPA）發(fā)現(xiàn)巖藻多糖的分子透過率值為10.4 × 10-6cm?s-1，推測(cè)其具有優(yōu)良的血腦屏障穿透性。Xu 等[19]利用Caco-2 細(xì)胞模型，將FITC 熒光標(biāo)記物嵌合到巖藻多糖分子中，發(fā)現(xiàn)巖藻多糖膜透過性良好，其在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)作用是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)的，提示其可能具有透過血腦屏障的能力，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖吸收后快速在腎臟和肝臟中富集，在腦和心臟中未檢測(cè)到巖藻多糖存在。甘露寡糖二酸（GV-971）是從海藻中提取的海洋寡糖類分子，在2019 年被國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)有條件上市，用于治療輕至中度阿爾茨海默病。研究表明，GV971能在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）的作用下透過血腦屏障，解聚Aβ 聚合體并抑制Aβ 寡聚體形成，同時(shí)還通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡、重塑機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而降低腦內(nèi)神經(jīng)炎癥，多靶點(diǎn)阻止AD 病程進(jìn)展[20]。黃娟等[21]發(fā)現(xiàn)高分子質(zhì)量的巖藻多糖可以調(diào)控小鼠腸道菌群并修復(fù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫功能。因此，巖藻多糖是否也是通過GLUT1 透過血腦屏障直接作用于神經(jīng)元并通過調(diào)控腸道菌群等多靶點(diǎn)改善記憶尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過建立AD 體外細(xì)胞損傷模型，首次發(fā)現(xiàn)巖藻多糖對(duì)Aβ25-35 誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用，且對(duì)其誘導(dǎo)的神經(jīng)突起萎縮具有再生作用。而巖藻多糖促進(jìn)神經(jīng)再生和神經(jīng)元保護(hù)的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖可以減少轉(zhuǎn)基因AD 秀麗線蟲中Aβ的積聚和 ROS 的產(chǎn)生，從而改善線蟲（Caenorhabditis elegans）的運(yùn)動(dòng)行為[22]。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)巖藻多糖可以通過抑制溶酶體組織蛋白D 的活性而抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡，Wei等[24]發(fā)現(xiàn)巖藻多糖可以抑制PC12 細(xì)胞凋亡并改善AD 小鼠的記憶障礙，其作用機(jī)制可能與膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)、減少氧化應(yīng)激和抑制Caspase 凋亡通路有關(guān)。巖藻多糖的分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，硫酸基取代和巖藻糖支鏈連接方式多樣，給揭示其抗AD 和神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制帶來困難，因此，在后續(xù)研究中通過對(duì)巖藻多糖進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)鑒定，得到結(jié)構(gòu)和分子量均一的巖藻多糖，將有助于闡明其對(duì)神經(jīng)元突起再生和AD 記憶改善的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

巖藻多糖可有效抑制Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元凋亡，抑制Aβ 誘導(dǎo)的突起萎縮并促進(jìn)神經(jīng)突起再生。