正交試驗優(yōu)化白花蛇舌草4種五環(huán)三萜類成分提取工藝

林艾和，劉海鵬，張艷嬌，黃寬，李蓉，范源，

正交試驗優(yōu)化白花蛇舌草4種五環(huán)三萜類成分提取工藝

林艾和1，劉海鵬2，張艷嬌1，黃寬1，李蓉1，范源1，2

1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216

優(yōu)選白花蛇舌草五環(huán)三萜類成分山楂酸（MA）、科羅索酸（CA）、齊墩果酸（OA）、熊果酸（UA）的最佳提取工藝。采用HPLC建立MA、CA、OA、UA含量測定方法，以MA、CA、OA、UA含量為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗，考察乙醇體積分數、提取時間、提取次數對提取效果的影響。MA、CA、OA、UA色譜峰分離度良好，分別在0.568～3.408 μg（2＝0.999 0）、0.582～3.492 μg（2＝0.999 0）、0.488～2.928 μg（2＝0.999 9）、0.720～4.320 μg（2＝0.999 2）范圍內呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為99.09%（RSD＝1.57%）、99.76%（RSD＝1.78%）、100.49%（RSD＝1.66%）、99.52%（RSD＝1.75%）。最佳提取工藝條件為：采用95%乙醇提取70 min，提取3次。本研究優(yōu)選的提取工藝合理、穩(wěn)定可行，可用于白花蛇舌草中MA、CA、OA、UA的提取。

白花蛇舌草；正交試驗；提取工藝；山楂酸；科羅索酸；齊墩果酸；熊果酸

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草Willd的干燥全草[1]，廣泛分布于我國浙江、江蘇、廣東、江西、云南等地[2]，其性寒，味苦、甘，歸胃、大腸、小腸經，具有清熱解毒、活血止痛、利尿消腫等功效，臨床用于治療濕熱黃疸、小便不利、咽喉腫痛、瘡癤腫痛、闌尾炎、毒蛇咬傷、盆腔炎、泌尿系感染等。白花蛇舌草主要含有多糖類、三萜類、有機酸類、黃酮類、蒽醌類、烷烴類、甾醇類、環(huán)烯醚苷萜類、生物堿等化學成分[3-5]。其中，三萜類化合物具有抗菌、消炎、抗癌、抗突變、抗氧化等藥理作用[6-9]。白花蛇舌草中三萜類化合物多為烏蘇烷型和齊墩果烷型，其中2組同分異構體化合物熊果酸（ursolic acid，UA）和齊墩果酸（oleanolic acid，OA）、科羅索酸（corosoic acid，CA）和山楂酸（maslinic acid，MA）含量較高，結構和化學性質相似，色譜峰出峰時間接近，分離測定存在一定難度[10-14]。本研究建立白花蛇舌草中MA、CA、OA和UA的HPLC定量分析方法，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優(yōu)化其提取工藝，為白花蛇舌草的開發(fā)利用提供依據。

1 儀器與試藥

YL-040S語路超聲波清洗機，深圳市即潔超聲科技有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD檢測器，Acclaim C30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），美國Agilent公司；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；D2KW-D電熱恒溫水浴鍋，上海量壹科學儀器有限公司；T-1000型電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；AB265-S十萬分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade（Shanghai）Co.LTD；旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司。

白花蛇舌草（批號P20190912，安國市旭芳中藥材經營有限公司），經云南中醫(yī)藥大學李國棟副教授鑒定為茜草科植物白花蛇舌草Willd的干燥全草。對照品MA（批號wkq18080306）、CA（批號wkq20042404）、OA（批號wkq18050212，）、UA（批號wkq20061211），純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 指標成分測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acclaim C30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動相：甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸水溶液（D）；梯度洗脫（0～10 min，75%B、12.5%C、12.5%D；10～20 min，70%B、15%C、15%D；20～25 min，75%B、12.5%C、12.5%D）；流速：0.1 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。理論塔板數按MA峰計算應不低于5000，分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.1.2 混合對照品溶液制備

分別精密稱取對照品MA 2.84 mg、CA 2.91 mg、OA 2.44 mg、UA 3.60 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇配制成MA、CA、OA、UA濃度分別為0.284、0.291、0.244、0.360 mg/mL的混合對照品溶液，低溫避光保存。

2.1.3 供試品溶液制備

取白花蛇舌草樣品，粉碎，過40目篩，精密稱定約1.0 g，置于圓底燒瓶中，進行回流提取，提取溫度90 ℃，料液比為1∶20，設置不同乙醇體積分數、提取時間及提取次數，合并提取液，過濾，濾液于60 ℃減壓回收溶劑至干，加50 mL水使混懸，用乙酸乙酯振搖萃取5次，每次50 mL，合并乙酸乙酯液，減壓回收溶液至干，殘渣加甲醇移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

注：A.對照品；B.供試品；1. MA；2. CA；3. OA；4. UA

2.1.4 線性關系考察

取“2.1.2”項下混合對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，依次精密吸取2、4、6、8、10、12 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。MA回歸方程為＝457.13－168.66（2＝0.999 0），線性范圍為0.568～3.408 μg；CA回歸方程為＝1007.7－398.94（2＝0.999 0），線性范圍為0.582～3.492 μg；OA回歸方程為＝657.6－70.54（2＝0.999 9），線性范圍為0.488～2.928 μg；UA回歸方程為＝1774.9－353.47（2＝0.999 2），線性范圍為0.720～4.320 μg。

2.1.5 精密度考察

精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結果MA、CA、OA、UA的峰面積RSD分別為1.92%、1.95%、1.69%、1.65%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，結果MA、CA、OA、UA峰面積RSD分別為1.70%、1.63%、1.95%、0.61%，表明供試品溶液在10 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗

取同一批樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，結果MA、CA、OA、UA含量RSD分別為1.28%、1.46%、1.24%、1.68%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品（每1.0 g樣品含MA 0.893 3 mg、CA 1.736 0 mg、OA 1.196 6 mg、UA 3.487 1 mg）粉末6份，每份精密稱取1.0 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，加入約等量MA、CA、OA、UA對照品，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率，結果見表1。

表1 白花蛇舌草中MA、CA、OA、UA加樣回收率試驗

成分取樣量 /g樣品中含量/mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率/%RSD /% MA1.013 70.850 40.927 41.792 3100.82 99.091.57 1.002 70.923 20.922 11.802 8 97.70 1.033 60.893 30.892 51.785 5 99.98 1.028 10.879 40.910 41.792 4100.15 1.047 70.913 20.905 11.802 1 99.11 1.029 40.925 00.872 31.739 6 96.79 CA1.014 01.685 61.745 53.387 6 98.73 99.761.78 1.017 21.703 11.694 23.325 9 97.90 1.068 21.736 01.727 13.502 8101.15 1.023 21.724 31.680 63.346 3 98.28 1.053 41.690 81.703 33.476 0102.41 1.058 11.783 61.698 83.485 2100.08 OA1.005 21.208 41.170 62.451 3103.04100.491.66 1.017 81.170 51.209 12.380 5100.04 1.028 91.196 61.217 92.377 3 98.46 1.085 71.194 11.164 52.385 3101.13 1.047 41.238 21.185 92.400 6 99.03 1.022 61.214 91.230 12.475 7101.26 UA1.039 73.301 63.597 86.834 7 99.0699.521.75 1.003 73.472 83.329 56.801 9 99.99 1.033 53.487 13.502 16.890 2 98.58 1.069 13.610 93.593 76.991 6 97.04 1.029 63.387 23.370 16.771 2100.21 1.002 33.602 13.580 37.342 3102.23

2.2 單因素試驗

采用加熱回流法提取白花蛇舌草中MA、CA、OA、UA。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，考察乙醇體積分數、提取時間及提取次數對指標成分含量（mg/g）的影響。指標成分含量（mg/g）＝供試品峰面積×對照品濃度（mg/mL）÷對照品峰面積。

2.2.1 乙醇體積分數

固定提取時間為70 min、提取次數為1次，考察不同乙醇體積分數（65%、75%、85%、95%）對MA、CA、OA、UA提取效果的影響，結果見圖2。隨著乙醇體積分數增加，MA、CA、OA、UA含量逐漸升高。綜合考慮，選擇乙醇體積分數為95%。

圖2 乙醇體積分數對白花蛇舌草MA、CA、OA、UA提取效果的影響

2.2.2 提取時間

固定乙醇體積分數為95%、提取次數為1次，考察不同提取時間（50、70、90、110、130 min）對MA、CA、OA、UA提取效果的影響，結果見圖3。MA含量在提取50～70 min增加，70～130 min減少；CA含量在提取50～130 min逐漸增加；OA含量在提取50～70 min增加，70～130 min減少；UA含量在提取50～70 min增加，此后較70 min均減少。綜合考慮，選擇提取時間為70 min。

圖3 提取時間對白花蛇舌草MA、CA、OA、UA提取效果的影響

2.2.3 提取次數

固定乙醇體積分數為95%、提取時間為70 min，考察不同提取次數（1、2、3、4次）對MA、CA、OA、UA提取效果的影響，結果見圖4。MA、OA含量隨提取次數增加而增大；CA、UA含量在提取3次時最高，提取4次時減少。綜合考慮，選擇提取次數為3次。

圖4 提取次數對白花蛇舌草MA、CA、OA、UA提取效果的影響

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗因素與水平

選取乙醇體積分數、提取時間、提取次數進行3因素3水平正交試驗，考察各因素對MA、CA、OA、UA含量的影響，因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平表

水平乙醇體積分數/%A提取時間/minB提取次數C 175 701 285 902 3951103

2.3.2 正交試驗結果及方差分析

分別精密稱取白花蛇舌草粉末1.0 g，按正交試驗設計進行試驗，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算MA、CA、OA、UA含量，并進行方差分析，結果見表3～表7。

表3 白花蛇舌草中4種成分L9（33）正交試驗結果（mg/g）

試驗號ABCMACAOAUA 11110.5020.7280.7102.344 21220.4230.6700.6302.173 31330.3440.9900.7492.673 42120.6071.1930.9592.906 52230.5941.2430.8341.705 62310.2490.7110.4611.277 73130.9261.7031.2533.493 83210.5461.1180.5681.115 93320.4360.8130.5891.075 K1（MA）0.4230.6780.432 K1（CA）0.7961.2080.852 K1（OA）0.6960.9740.580 K1（UA）2.3972.9141.579 K2（MA）0.4830.5210.489 K2（CA）1.0491.0100.892 K2（OA）0.7510.6770.726 K2（UA）1.9631.6642.051 K3（MA）0.6360.3430.621 K3（CA）1.2110.8381.312 K3（OA）0.8030.6000.945 K3（UA）1.8941.6752.624 R（MA）0.2130.3350.189 R（CA）0.4150.3700.460 R（OA）0.1070.3740.365 R（UA）0.5031.2501.045

表4 MA含量正交試驗結果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.07221.1256.940 B0.16922.6416.940P＜0.05 C0.05620.8756.940 誤差0.1304

表5 CA含量正交試驗結果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.26321.27719.000 B0.20621.00019.000 C0.38921.88819.000 誤差0.2102

表6 OA含量正交試驗結果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.0172 1.00019.000 B0.234213.76519.000P＜0.05 C0.203211.94119.000P＜0.05 誤差0.0202

表7 UA含量正交試驗結果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.44521.00019.000 B3.09926.96419.000P＜0.05 C1.64323.69219.000 誤差0.4502

以MA含量為指標，3個因素對提取效果的影響為B＞A＞C；以CA含量為指標，3個因素對提取效果的影響為C＞A＞B；以OA含量為指標，3個因素對提取效果的影響為B＞C＞A；以UA含量為指標，3個因素對提取效果的影響為B＞C＞A。以A、C為誤差列分別對MA含量進行方差分析，結果B因素對MA含量影響顯著；以B為誤差列對CA含量進行方差分析，結果A、B、C因素均對CA含量無顯著影響；以A為誤差列對OA含量進行方差分析，結果B、C因素對OA含量影響顯著；以A為誤差列對UA含量進行方差分析，結果B因素對UA含量影響顯著。

提取工藝A3B1C3的提取效果最佳，在此條件下MA、CA、OA和UA含量分別為0.926、1.703、1.253、3.493 mg/g。綜合考慮，最佳提取工藝組合為A3B1C3，即95%乙醇提取70 min，提取3次。

2.3.3 驗證試驗

平行稱取樣品粗粉3份，每份1.0 g，精密稱定，按優(yōu)選工藝進行驗證，結果見表8。表明正交試驗優(yōu)選的工藝條件較好，合理可行。

表8 白花蛇舌草中4種成分提取工藝驗證試驗結果（mg/g）

編號MACA OA UA 10.9311.6691.2743.527 20.8951.6711.2163.412 30.9181.7321.2723.528 平均含量0.9151.6911.2543.489 RSD/%1.992.122.631.91

3 討論

MA、CA、OA和UA均為白花蛇舌草中的五環(huán)三萜類化合物，MA與CA、OA與UA分別為同分異構體，結構相似，MA是OA的衍生物，CA是UA的衍生物。這2組同分異構體在中性流動相中可解離，常規(guī)色譜條件很難使其達到基線分離。本研究在多次預試驗基礎上，發(fā)現以甲醇、乙腈、磷酸共同作為流動相使用能很好提高其分離度，改善色譜峰的峰形，出峰時間適合。經反復試驗，調整甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液三者的比例，最終以甲醇（B）-乙腈（C）- 0.1%磷酸水溶液（D）為流動相梯度洗脫，2組同分異構體的分離度均大于1.5，達到了檢測要求。進而以MA、CA、OA和UA含量為指標，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗對影響提取效果的乙醇體積分數、提取時間、提取次數進行分析，得到最佳提取工藝參數。

白花蛇舌草臨床應用廣泛，但現有的質量控制研究文獻報道較少，其優(yōu)化提取工藝多以UA為評價指標。OA是UA同分異構體，MA為OA衍生物，CA為UA衍生物且二者含量較高，僅以UA為檢測指標存在局限性，難以較好優(yōu)化其提取工藝。本試驗以MA、CA、OA、UA為指標成分，指標選擇更為合理，結果更準確，更適用于白花蛇舌草有效成分的提取工藝優(yōu)化。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：附錄23.

[2] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草精選本[M].上海：上?？茖W技術出版社,1998：433.

[3] 李波.白花蛇舌草的化學成分和藥理作用研究進展[J].天津藥學, 2016,28(5)：75-78.

[4] 鄒香妮,閆珺.白花蛇舌草抗腫瘤化學成分及作用機制研究進展[J].化學工程師,2020,34(3)：47-49,56.

[5] 楊新周,田孟華,楊子仙,等.白花蛇舌草中黃酮、多酚、多糖提取工藝及抗氧化研究[J].化學研究與應用,2019,31(1)：22-30.

[6] WANG C, ZHOU X, WANG Y, et al. The antitumor constituents fromWilld[J]. Molecules,2017,22(12)：2101.

[7] 劉梟,許云,徐銀瑩,等.白花蛇舌草治療子宮肌瘤機制的網絡藥理學研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2020,31(9)：1070-1078.

[8] 王驍,范煥芳,李德輝,等.白花蛇舌草的抗癌作用研究進展[J].中國藥房,2019,30(10)：1428-1431.

[9] 車宏偉,楊海寧,譚曉川,等.白花蛇舌草不同提取部位抗腫瘤作用研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2019,15(3)：191-193.

[10] 吳燕.高效液相色譜法測定不同產地白花蛇舌草中齊墩果酸的含量[J].海峽藥學,2016,28(5)：58-59.

[11] 王歡,吳瑩,黃嫣,等.HPLC-DAD同時測定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].中藥與臨床,2016,7(1)：20-22,36.

[12] 李敏,齊紅,于姍姍,等.市售白花蛇舌草正品及偽品中齊墩果酸和熊果酸的含量測定[J].中國藥物經濟學,2020,15(7)：49-52.

[13] 楊新周,吳娜,邱曉雪.HPLC法測定云南不同產地白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量[J].貴州農業(yè)科學,2019,47(10)：115-118.

[14] 劉慧妍,黃馨慧,張艷海.HPLC法快速測定8種中藥中齊墩果酸和熊果酸[J].中草藥,2017,48(10)：1998-2001.

Optimization of Extraction Technology of Four Pentacyclic Triterpenes fromby Orthogonal Experiment

LIN Aihe1, LIU Haipeng2, ZHANG Yanjiao1, HUANG Kuan1, LI Rong1, FAN Yuan1,2

To optimize the extraction technology of pentacyclic triterpenes maslinic acid (MA), corosoic acid (CA), oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) from.A method for the determination of MA, CA, OA and UA was established by HPLC. The contents of MA, CA, OA and UA were set as evaluation indexes, and the effects of ethanol volume fraction, extraction time and extraction times on the extraction efficiency were investigated by single factor and orthogonal experiment.MA, CA, OA, UA had good resolution of chromatographic peak, showing good linear relationships in the ranges of 0.568–3.408 μg (2=0.999 0), 0.582–3.492 μg (2=0.999 0), 0.488–2.928 μg (2=0.999 9), 0.720–4.320 μg (2=0.999 2), respectively. The recovery rates were 99.09% (RSD=1.57%), 99.76% (RSD=1.78%), 100.49% (RSD=1.66%) and 99.52% (RSD=1.75%), respectively. The optimal extraction technology conditions were: 95% ethanol extraction for 70 min, 3 times for extraction.The optimal extraction technology is reasonable, stable and feasible., and can be used to extract MA, CA, OA and UA from.

; orthogonal experiment; extraction technology; maslinic acid; corosoic acid; oleanolic acid; ursolic acid

R284.2

A

1005-5304(2021)06-0083-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202010251

云南省高等學校重點實驗室建設計劃（2019－2022年）

范源，E-mail：1647909799@qq.com

（2020-10-19）

（2020-11-30；編輯：陳靜）