宮頸鱗癌組織中HIF-1α、YAP、TAZ蛋白表達(dá)變化及意義

馮倩倩，阿孜爾古麗·阿布都克日木，努爾比亞木·買買提依明，陳曉琳，斯依提阿吉·麥麥提明，史娟，馬紅

1 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，烏魯木齊830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物教研室

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。我國(guó)宮頸癌病死率整體呈上升趨勢(shì)［1-2］。從宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）到宮頸癌的發(fā)生，是多步驟、多基因參與的長(zhǎng)期復(fù)雜過(guò)程，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌預(yù)后差的主要原因。因此，探討宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找早期診斷和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)是宮頸癌研究中亟待解決的重大問(wèn)題。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）是維持細(xì)胞內(nèi)氧代謝平衡的重要調(diào)控因子，其表達(dá)或活性增加與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 激活 Hippo 信號(hào)通路，通過(guò)上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、血管生成等促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［4］。Yes 激酶相關(guān)蛋白（YAP）和PDZ 結(jié)合模序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）是Hippo 下游通路的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄共激活因子［5］。本課題組前期研究發(fā) 現(xiàn) ，宮 頸 癌 siha、C33A 細(xì) 胞 中 HIF-1α、YAP、TAZ mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，慢病毒干擾HIF-1α 表達(dá)后可抑制siha、C33A 細(xì)胞侵襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究觀察了 CSCC 組織中HIF-1α、YAP、TAZ 的表達(dá)變化及其相互關(guān)系，旨在探討三者與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源 收集醫(yī)院病理科2016 年1 月—2019 年7 月存檔的石蠟包埋組織。CSCC 組織40例，癌旁正常宮頸組織30 例?；颊吣挲g31~83 歲，所有患者術(shù)前均無(wú)放療、化療及免疫治療史，高分化19 例、中低分化21 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15 例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 25 例。CIN 組織 58 例（CIN I 級(jí) 32 例、Ⅱ~Ⅲ級(jí)26例），患者年齡28~78歲。

1.2 HIF-1α、YAP、TAZ 檢測(cè) 采用免疫組化 SP 法檢測(cè)CSCC 組織、CIN 組織及癌旁正常宮頸組織中的HIF-1α、YAP、TAZ 蛋白。兔抗人HIF-1α、YAP、TAZ多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。SP 免疫組化試劑盒和DAB 顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟包埋組織進(jìn)行連續(xù)3 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后微波爐抗原修復(fù)，滴加3%H2O220 μL阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后滴加一抗4 ℃冰箱培育過(guò)夜。HIF-1α、YAP、TAZ 抗體的工作液濃度分別為1∶100、1∶150 和1∶200。次日滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min。各步驟間隔均用 PBS 緩沖液（pH 7.4）沖洗 3 遍（10 min）。DAB 顯色，蘇木精對(duì)比染色，常規(guī)乙醇逆濃度梯度脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。每批染色均以上述抗體已知陽(yáng)性的切片作陽(yáng)性對(duì)照，以0.01 mol/L的PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。HIF-1α 蛋白表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞核，YAP 和TAZ 蛋白表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。隨機(jī)每張切片取10 個(gè)高倍視野（200×）觀察陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥25%判定為蛋白表達(dá)陽(yáng)性，細(xì)胞無(wú)染色或陽(yáng)性細(xì)胞百分比<25%判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSCC 組織、CIN 組織及癌旁正常宮頸組織中 HIF-1α、YAP 和 TAZ 蛋白表達(dá)比較 CSCC、CIN 組織中 HIF-1α、YAP、TAZ 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常宮頸組織（P均<0.05）。中低分化的CSCC 組織中YAP 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于高分化組織；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CSCC 組織中TAZ 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織（P均<0.05）。詳見(jiàn)圖1、表1。

圖1 CSCC組織、CIN組織及癌旁正常宮頸組織中HIF-1α、YAP和TAZ蛋白表達(dá)情況（免疫組化SP法）

表1 CSCC組織、CIN組織及癌旁正常宮頸組織中HIF-1α、YAP和TAZ蛋白表達(dá)比較［例（%）］

2.2 CSCC組織中HIF-1α、YAP、TAZ蛋白表達(dá)的相關(guān)性 40 例 CSCC 組織中，HIF-1α 與 YAP 蛋白均陽(yáng)性表達(dá) 23 例、均陰性表達(dá) 8 例、HIF-1α 蛋白陽(yáng)性且YAP 蛋白陰性 3 例、HIF-1α 蛋白陰性且 YAP 蛋白陽(yáng)性6例，HIF-1α與YAP蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.487，P<0.05）；HIF-1α 與 TAZ 蛋白均陽(yáng)性表達(dá) 20 例、均陰性表達(dá) 7 例、HIF-1α 蛋白陽(yáng)性且 TAZ 蛋白陰性 6例、HIF-1α 蛋白陰性且 TAZ 蛋白陽(yáng)性 7 例，HIF-1α與TAZ 蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.274，P>0.05）；YAP及TAZ蛋白均陽(yáng)性表達(dá)21例、均陰性表達(dá)5例、YAP蛋白陽(yáng)性且TAZ 蛋白陰性8 例、YAP 蛋白陰性且TAZ 蛋白陽(yáng)性 6 例，YAP 與 TAZ 蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.170，P>0.05）。

3 討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性生命健康［1］。宮頸癌在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率和病死率遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家［2］。缺氧是大多數(shù)實(shí)體腫瘤的共同特征。HIF-1α 的表達(dá)和活性受氧濃度的精密調(diào)節(jié)，是細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)增加可增強(qiáng)腫瘤糖酵解、細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成和EMT，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［6］。JAN 等［7］通過(guò)移植小鼠模型研究顯示，在腺苷酸激酶4過(guò)表達(dá)激活HIF-1α，進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)肺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。COWMAN 等［8］在腎透明細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與高腫瘤高分級(jí)和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與總生存率降低獨(dú)立相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常宮頸組織相比，HIF-1α 蛋 白在 CIN、CSCC 組織中表達(dá)升高，與YANG 等［9］研究結(jié)果一致。盡管 HIF-1α 蛋白在CINⅠ級(jí)和CIN Ⅱ~Ⅲ級(jí)的表達(dá)差異無(wú)顯著性，但總體呈上升趨勢(shì)，提示從CIN 向腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中，異型細(xì)胞增生活躍，缺氧微環(huán)境刺激下HIF-1α 表達(dá)升高，參與 CSCC 的發(fā)生發(fā)展。YAN 等［10］亦發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中HIF-1α 表達(dá)越高，預(yù)后越差。本研究發(fā)現(xiàn)CSCC 組織中HIF-1α 表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果一致［11］，但隨著分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移其表達(dá)呈上升趨勢(shì)，提示HIF-1α 蛋白表達(dá)增強(qiáng)可能與預(yù)后不良有關(guān)。

Hippo 通路是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的抑癌通路，通過(guò)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。Hippo 通路失活參與了腫瘤的發(fā)生［12］。最近研究強(qiáng)調(diào)了Hippo 通路在控制腫瘤生長(zhǎng)、保持細(xì)胞增殖與凋亡平衡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)方面的作用，其核心效應(yīng)因子YAP/TAZ的過(guò)度激活可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控和惡性轉(zhuǎn)化［13］。TOTARO 等［14］發(fā) 現(xiàn) Hippo 信 號(hào) 通 路 的 失 活 可 使YAP/TAZ 過(guò)表達(dá)。HE 等［15］研究顯示，YAP 在宮頸上皮細(xì)胞中的過(guò)度激活可誘導(dǎo)HPV 受體表達(dá)，破壞宿主細(xì)胞天然免疫，YAP 差異激活和表達(dá)決定了個(gè)體對(duì)HPV 的易感性。在乳腺癌細(xì)胞中，HIF-1α 和TAZ 相互作用，HIF-1α 增加 TAZ 的合成和核定位來(lái)刺激TAZ 表達(dá)和活性，抑制TAZ 表達(dá)會(huì)影響HIF-1α靶 基 因 的 低 氧 誘 導(dǎo)［16］。 CHOI 等［17］研 究 顯 示 ，YAP/TAZ 的激活啟動(dòng)了胃癌的發(fā)病并導(dǎo)致下游MYC 表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，YAP、TAZ 蛋白在 CIN、CSCC 組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織，并與CSCC 分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，YAP、TAZ 蛋白在CIN Ⅱ~Ⅲ級(jí)組織中的表達(dá)高于CIN Ⅰ級(jí)組織，提示CSCC的發(fā)生發(fā)展可能與YAP、TAZ過(guò)表達(dá)有關(guān)。

近年來(lái)研究表明，腫瘤細(xì)胞中YAP、TAZ表達(dá)受HIF-1α 的調(diào)節(jié)，通過(guò)EMT、血管生成等促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［18］。LIN等［19］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α可異常激活 YAP/TAZ，而 RASFF、MER 表達(dá)缺失，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。ZINATIZADEH 等［20］發(fā)現(xiàn)，低氧條件下 HIF-1α 對(duì) YAP、TAZ 的調(diào)節(jié)方向和機(jī)制不同，在腫瘤細(xì)胞中HIF-1α 上調(diào)TAZ 表達(dá)，降低YAP 和磷酸化蛋白（S127）表達(dá)，通過(guò)激活ERK/MAPK 通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果也顯示，CSCC 組織中HIF-1α與YAP蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，因此推測(cè)HIF-1α可能通過(guò)激活YAP表達(dá)促進(jìn)CSCC的發(fā)生發(fā)展。而HIF-1α 和TAZ 的關(guān)系還需增加樣本量進(jìn)一步論證。

綜上所述，HIF-1α、YAP、TAZ蛋白在CIN、CSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常宮頸組織，且YAP、TAZ表達(dá)與CSCC 分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示HIF-1α、YAP、TAZ 可能在 CIN 惡性轉(zhuǎn)化、CSCC的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用，有望成為CSCC 治療的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。