1種鑒別草地貪夜蛾性別的分子標記引物的開發(fā)

林妗蓓，韋加奇，王佳麗，朱 劍，李 茂，徐漢虹，林 菲

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，廣東 廣州510642)

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda為鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬，該蟲源自北美，2019年1月入侵我國云南省，并迅速擴展到全國26個省份[1-3]。作為聯(lián)合國糧農(nóng)組織全球預(yù)警的跨國界遷飛性重大害蟲，草地貪夜蛾具有寄主范圍寬、適生區(qū)域廣、增殖能力強、擴散速度快、突發(fā)危害重等特點[4-5]。

與其他鱗翅目昆蟲一樣，草地貪夜蛾主要在幼蟲時期為害。目前草地貪夜蛾雌、雄幼蟲為害行為性別差異的研究較少，因為缺乏幼蟲性別鑒定的快速簡便的手段。與許多鱗翅目昆蟲一樣，草地貪夜蛾在蛹和成蟲時期不再取食，因此幼蟲時期的取食量對其化蛹、羽化、產(chǎn)卵、遷飛等行為具有重要影響，不同性別的幼蟲取食量存在差異。林玉英等[5]對椰子織蛾Opisina arenosella1齡幼蟲取食量的研究表明，雌蟲取食量顯著大于雄蟲，結(jié)合幼蟲取食量可作為其齡期的判斷依據(jù)之一，從而為制定椰子織蛾防控措施奠定基礎(chǔ)；同時，大量研究表明，昆蟲幼蟲在抵抗高溫、抗核型多角體病毒等方面有性別差異[6-8]，成蟲在感光、觸角結(jié)構(gòu)等方面也存在顯著的性別差異[9]，昆蟲在取食、感光、抗病等行為上的性別差異研究，可為農(nóng)業(yè)害蟲的精準防控提供理論支持。因此，性別鑒定可以作為研究昆蟲雌、雄行為差異的一種便捷有效的工具，有助于制定更加精準高效的農(nóng)業(yè)害蟲防控治理策略。

目前，草地貪夜蛾的性別主要是通過蛹期和成蟲時期的外露生殖器及翅上的斑紋差異進行區(qū)分[10-11]。草地貪夜蛾入侵中國后，性信息素誘捕、高空燈誘捕在蟲情預(yù)測預(yù)報中發(fā)揮了非常重要的作用。由于缺乏對幼蟲形態(tài)學(xué)有效的判斷標準，而田間捕捉的草地貪夜蛾成蟲非?；钴S，鱗羽容易掉落，給性別鑒定造成了困難，影響了測報結(jié)果的準確性。對于鱗羽掉落的草地貪夜蛾樣本和未經(jīng)過性別鑒定的DNA樣本，也缺乏有效的性別鑒定手段。因此，根據(jù)雌、雄蟲性信息素結(jié)合蛋白(Pheromone-binding protein, PBP)基因的序列差異，開發(fā)簡便、準確的功能性分子標記，對鑒定幼蟲期乃至成蟲期的草地貪夜蛾的性別具有理論和實際應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

草地貪夜蛾為實驗室飼養(yǎng)種群，飼養(yǎng)條件參考王世英等[12]方法，溫度為 (26.0±0.5) ℃；相對濕度為65%±5%；光周期為 16 h 光∶8 h 暗。

1.2 試驗方法

1.2.1 草地貪夜蛾雌、雄蟲分子標記引物的設(shè)計通過在線網(wǎng)站(https://pfam.xfam.org)尋找并下載PBP隱馬爾科夫模型，使用Bio-Linux軟件進行生物信息學(xué)分析得到草地貪夜蛾P(guān)BP基因家族的氨基酸序列，通過在線網(wǎng)站(http://www.omicsclass.com/article/681)手動確認每個蛋白的結(jié)構(gòu)域，總共篩選得到21個PBP，使用Bio-Linux軟件進行生物信息學(xué)分析獲得對應(yīng)蛋白的CDS序列等相關(guān)信息，所得序列與NCBI上已發(fā)表的PBP基因序列進行比對，比對結(jié)果為本研究的PBP基因的CDS序列與已發(fā)表的4個PBP基因(SfruPBP1、SfruPBP2、SfruPBP3、SfruPBP4)[13]的CDS序列不存在相似性(結(jié)果未顯示)。對獲得的各基因片段進行PCR測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sf-10911基因序列在雌、雄個體中存在較大差異。通過多個已知雌、雄樣本檢測后，確認該基因為性別差異基因，針對草地貪夜蛾雌、雄蟲Sf-10911基因的差異區(qū)段設(shè)計了3對引物(表1)，開發(fā)雌、雄性別鑒定的特異標記，引物設(shè)計見圖1。利用設(shè)計合成的引物，對鑒別過已知性別的草地貪夜蛾蟲蛹樣本進行PCR擴增，篩選得到分子標記。

表 1 引物序列表Table 1 List of primer sequence

圖 1 草地貪夜蛾性別鑒定引物設(shè)計Fig. 1 Primers design for sexual identification of Spodoptera frugiperda

1.2.2 草地貪夜蛾蛹期DNA提取及PCR擴增 根據(jù)草地貪夜蛾蛹期雌、雄蟲形態(tài)差異區(qū)分出雌、雄后(圖2)，利用微量樣品基因組DNA 提取試劑盒進行DNA的提取。采用雌、雄特異性引物對提取的DNA樣本進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選分子標記。PCR 擴增的體系為：PrimerSTAR Max 6.25 μL，上游和下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，模板 0.5 μL，加 ddH2O 至15 μL。PCR 擴增的反應(yīng)程序為：98 ℃ 預(yù)變性2 min；98 ℃ 變性 10 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。

圖 2 草地貪夜蛾蛹期雌、雄蟲腹部末端差異對比Fig. 2 Distinction between abdomen ends of male and female of Spodoptera frugiperda at pupal stage

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾性別鑒定引物的開發(fā)及篩選

針對草地貪夜蛾雌、雄蟲Sf-10911基因的性別差異區(qū)段設(shè)計了3對引物，開發(fā)性別鑒定的特異標記。利用設(shè)計合成的3對引物，對已知性別的草地貪夜蛾樣本進行PCR擴增，篩選得到分子標記，該分子標記可以擴增出450 bp左右的條帶。之后，利用篩選出的分子標記對經(jīng)過形態(tài)鑒定的雌、雄蟲樣本再次進行PCR擴增。

首先，利用3對標記引物擴增草地貪夜蛾的雌、雄蟲DNA樣本，所用樣本為經(jīng)過測序鑒定的雌、雄蟲DNA樣本；圖3表明，引物Sf-female-R-1、Sf-male-R-3搭配Sf-F均不能擴增出特異條帶；搭配引物Sf-F擴增時，其中雄性樣本可以用雄性特異性引物Sf-male-R-2擴增得到特異條帶，而雌性樣本只有雌性特異性引物Sf-female-R-2可以擴增得到特異條帶，與測序結(jié)果一致。因此，選擇Sffemale-R-2和Sf-male-R-2作為草地貪夜蛾雌、雄蟲特異性引物。

圖 3 3對引物對草地貪夜蛾雌、雄蟲樣本的擴增Fig. 3 Amplification of different sexual samples of Spodoptera frugiperda by three pairs of primers

2.2 性別分子標記引物對草地貪夜蛾的鑒定

為進一步驗證篩選出的標記引物的準確性，對經(jīng)過形態(tài)鑒定的雌、雄蟲蛹進行PCR檢測(圖4)。從圖4可以看出，利用雌蟲標記引物Sf-female-R-2擴增雌、雄蟲DNA樣本時，只有雌蟲才能擴增出450 bp左右的特異性條帶；用雄蟲標記引物Sf-male-R-2擴增雌、雄蟲DNA樣本時，只有雄蟲才能擴增出450 bp左右的特異性條帶。檢測結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致，說明篩選出的引物適用于草地貪夜蛾的性別鑒定。

圖 4 基于PCR擴增對草地貪夜蛾雌、雄蟲蛹性別鑒定Fig. 4 Sex identification of male and female pupae of Spodoptera frugiperda based on PCR amplification

3 討論與結(jié)論

農(nóng)業(yè)害蟲的性別鑒定對于害蟲的有效防治和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。不同性別的昆蟲在蟲體形態(tài)上往往存在差異，甜菜夜蛾Spodoptera exiguaHübner、桉袋蛾Acanthopsyche subferalbataHampson以及鳳凰木夜蛾P(guān)ericyma cruegri在其蛹及成蟲時期的形態(tài)存在明顯的性別差異[14-16]，利用這種形態(tài)上的差異，研究人員可以快速簡便地鑒定雌、雄蟲，及時為田間種群動態(tài)的監(jiān)測和預(yù)測預(yù)報提供數(shù)據(jù)。

利用雌、雄蟲形態(tài)差異鑒定性別的方法雖然簡單快捷，但卻無法對一些不存在性別形態(tài)差異或是生長發(fā)育早期無形態(tài)差異的昆蟲進行鑒定。牛寶龍等[17]以棉鈴蟲Helicoverpa armigera雌、雄蟲基因組DNA為模板，篩選了1條雌特異隨機擴增多態(tài)性 DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)，根據(jù)該特異性分子標記的核苷酸序列設(shè)計雌性特異引物，并對棉鈴蟲基因組DNA進行PCR擴增，雌性棉鈴蟲可以擴增出目的條帶，可將此標記用于棉鈴蟲幼蟲乃至胚胎的性別鑒定；王慧超等[18]也早在2004年運用RADP技術(shù)對家蠶Bombyx moriLinnaeus上得到的雌特異性片段設(shè)計引物并進行了PCR驗證。此外，張利娜[19]從外部形態(tài)學(xué)、血清生化指標建立了鰻鱺Anguilla japonica的性別判定函數(shù)，用SRAP分子標記獲得F5R2雌性特異DNA序列，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計序列特定擴增區(qū)域(Sequence characterized amplified regions，SCAR)特異引物并進行性別鑒定；Masaru等[20]用日本青鳉Oryzias latipes的雄性Y特異性DM結(jié)構(gòu)域基因開發(fā)引物鑒定了弓背青鳉Oryzias curvinotus的遺傳性別；中國大鯢Andrias davidianus、雙須骨舌魚Osteoglossum bicirrhosum的性別鑒定也利用雌、雄蟲基因差異序列開發(fā)分子標記引物并進行了有效的驗證[21-22]。

PBP在草地貪夜蛾的信息素識別過程中發(fā)揮著重要作用，雄蟲通過觸角感受雌蟲性腺釋放的性信息素，尋找合適的交配對象。PBP的功能特征決定了其基因序列以及表達模式在雌、雄蟲之間必然存在差異，具有明顯的性二型性[23]。牛小慧[24]對甜菜夜蛾的不同PBP進行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PBP在雌、雄蟲之間的表達量存在顯著差異；劉蘇等[13]通過對草地貪夜蛾4個PBP基因的克隆及表達模式分析發(fā)現(xiàn)，定位于成蟲觸角上的SfruPBP1和SfruPBP2蛋白在雄蟲中具有更高的表達量。本研究發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾雌、雄蟲中的PBP基因Sf-10911存在核苷酸序列差異，進而根據(jù)該差異設(shè)計了針對雌、雄蟲擴增的引物對，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出450 bp左右的特異條帶，作為其性別鑒定的分子標記，以期為研究草地貪夜蛾某些性狀可能存在的性別差異提供快速有效的手段。