大豆GmPIN2b調(diào)控根系響應(yīng)低磷脅迫的功能研究

劉國選，陳 康，陸 星，田 江，梁翠月

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院/根系生物學(xué)研究中心，廣東 廣州 510642)

大豆Glycine max是重要的糧油作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，為食品和畜牧業(yè)提供了重要的蛋白和油脂來源，也是生物柴油生產(chǎn)的主要原料[1-2]。我國南方水熱條件充足，但土壤大多呈酸性，酸性土壤中磷的有效性低是限制大豆生產(chǎn)的重要因子[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)改變根系形態(tài)構(gòu)型是大豆適應(yīng)低磷脅迫的重要機制之一[5-6]。低磷條件下，大豆根冠比、根長度、根毛密度以及側(cè)根數(shù)量均顯著提高。根系形態(tài)構(gòu)型的這些變化，增加了植物根系與土壤接觸的面積，促進(jìn)了植株對土壤磷的吸收和利用[7]。另外，趙靜等[8]研究表明，淺根型大豆品種的生物量、磷含量和產(chǎn)量均明顯高于深根型大豆品種，說明淺根型大豆對耕層土壤磷的吸收效率更高。因此，根系的向重性反應(yīng)對于植株利用土壤中異質(zhì)分布的磷至關(guān)重要[9-12]。

生長素是植物根系形態(tài)建成中的重要調(diào)控因子[13]。前期研究顯示，生長素的不對稱分布在植物的根系生長和根系向重性反應(yīng)中均起到了重要的調(diào)控作用[13-14]。植物的PIN(PIN-FORMED)基因家族是介導(dǎo)植物根系生長素不對稱分布的重要因子[15]。模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana的基因組中存在8個AtPIN同源基因[16]。其中，AtPIN2介導(dǎo)了生長素從根尖側(cè)皮層細(xì)胞到根伸長區(qū)皮層細(xì)胞的極性運輸[17]。研究顯示，在擬南芥根系向重性反應(yīng)的過程中，根尖細(xì)胞的AtPIN2蛋白發(fā)生不對稱分布，使生長素在根系向地面的伸長區(qū)積累，抑制了向地側(cè)伸長區(qū)細(xì)胞的伸長，最終導(dǎo)致根系生長彎曲，產(chǎn)生向重性反應(yīng)[14, 18]。因此，AtPIN2突變后，突變體根部下側(cè)的生長素分布受到抑制，根系的向地性功能明顯缺失[19]。水稻、番茄、玉米、毛白楊、葡萄和桉樹等植物的PIN2同源基因也有類似的保守結(jié)構(gòu)或功能[20-23]。例如，水稻的同源基因OsPIN2可以回補擬南芥突變體Atpin2的表型缺陷，且OsPIN2的回補表達(dá)可以恢復(fù)突變體Atpin2在向重情況下根尖生長素的極性分布，說明OsPIN2通過影響根尖生長素的極性轉(zhuǎn)運調(diào)控了根系生長夾角，在水稻根系的重力反應(yīng)中起重要作用[20, 24-25]。

雖然關(guān)于PIN2基因在其他植物中的功能已取得較大的研究進(jìn)展，但大豆中PIN2的同源基因是否也具有類似的功能，且是否參與了低磷脅迫對大豆根系形態(tài)建成的調(diào)控尚未清楚。因此，本研究首先對大豆GmPIN基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析；然后，選取與擬南芥AtPIN2同源性較高的GmPIN2b作為研究對象，利用實時熒光定量PCR測定該基因響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式；進(jìn)一步在擬南芥Atpin2突變體中回補表達(dá)該基因，并對轉(zhuǎn)基因植株的生長和根系向重性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗采用的大豆材料為‘粵春03-3’，供試擬南芥為哥倫比亞野生型Col-0和Atpin2突變體CS8058。擬南芥Atpin2突變體由浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院毛傳澡教授課題組惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 以 AtPIN2 氨基酸序列為參考，在植物基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome (http://www.phytozome.org/index.php)中通過BLAST比對獲得擬南芥、大豆和水稻Oryza sativaL.等植物的PIN同源基因的氨基酸序列，再利用軟件MEGA5.05的鄰接法(Neighbor-joining method)生成進(jìn)化樹。在SOYBASE數(shù)據(jù)庫(https://www.soybase.org/soyseq/)中獲得GmPIN基因的組織表達(dá)數(shù)據(jù)，在已發(fā)表的大豆根系轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[26]中獲得不同磷處理條件下GmPIN基因的表達(dá)水平的數(shù)據(jù)，通過TBtools軟件將這些數(shù)據(jù)制作成表達(dá)模式熱圖。

1.2.2 大豆低磷脅迫處理 挑選種皮無破損、大小均一的大豆種子，利用10%(φ)次氯酸鈉溶液表皮消毒后，在沙子中萌發(fā)。待幼苗子葉張開，將幼苗轉(zhuǎn)移至Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行不同磷水平的處理。其中，高磷處理的KH2PO4濃度為250 μmol/L，低磷處理的 KH2PO4濃度為 25 μmol/L。處理 3、6、12和15 d后，分析植株鮮質(zhì)量、總根長和根冠比，其中根冠比的計算方法為地下部鮮質(zhì)量與地上部鮮質(zhì)量的比值；同時收取根系樣品用液氮速凍后用于基因表達(dá)水平的測定。每個處理設(shè)4次重復(fù)。

1.2.3 大豆GmPIN2b基因的克隆 從 Phytozome數(shù)據(jù)庫中獲得大豆GmPIN2b(Glyma.17G057300)的CDS序列，根據(jù)該序列設(shè)計正向引物(ATGATC ACTGGTAAGGATATTTATG)和反向引物(TTAAACTCCAAGCAGCACGTA)。以大豆‘粵春03-3’根系cDNA為模板，擴增GmPIN2b基因，將所得的PCR產(chǎn)物連接T載體，測序驗證，選取陽性克隆保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 回補表達(dá)GmPIN2b的擬南芥Atpin2突變體材料的構(gòu)建 以擬南芥根系基因組DNA為模板，設(shè)計正向引物(TATGACCATGATTACGAATTCG CCCCTAGACCAAAATAATATGG)和反向引物(CATAAATATCCTTACCAGTGATCATTTTGATT TACTTTTTCCGGC)擴增擬南芥AtPIN2基因，翻譯起始密碼子上游3 229 bp的啟動子片段。以大豆根系cDNA為模板，設(shè)計正向引物(GCTACAAACCC TGCATTAACCATGATCACTGGTAAGGATATTT ATG)和反向引物(CCGGGTACCGAGCTCGAATTC TTAAACTCCAAGCAGCACGTA)擴增GmPIN2b基因編碼框全長。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(美基生物，上海)進(jìn)行純化回收。用SalI對目標(biāo)載體pCAMBIA1300進(jìn)行酶切，獲得線性化的載體。用Exnase?Multis(諾唯贊生物，中國)將上述PCR純化產(chǎn)物與線性化pCAMBIA1300進(jìn)行多片段連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，經(jīng)過測序無誤后抽取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

將GV3101平板劃線活化，挑取單克隆接種于添加卡那霉素和利福平添加劑量均為10 μg/mL的10 mL YEP 培養(yǎng)液中，放置培養(yǎng)箱于 180 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)過夜。之后取3 mL菌液轉(zhuǎn)入100 mL YEP 培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，然后 5000 r/min離心10 min，收集菌體，用等體積的1/4MS培養(yǎng)液重懸菌體并加入0.02%(φ)SilwetL-77配成擬南芥轉(zhuǎn)化液。利用花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥突變體Atpin2，獲得pAtPIN2::GmPIN2b回補表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系，T3代純合后用于進(jìn)一步試驗分析。擬南芥AtPIN2基因的檢測引物為At-F(正向引物)：CCTTGCTTGGTCCCTTGTCT，At-R(反向引物)：ATCGCAAACCCTGCTACTGA；pAtPIN2::GmPIN2b回補表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的檢測引物為 At-F1(正向引物)：GTGCATGAACGACTA CAATGG，Gm-R1(反向引物)：GAAAGAA G T G G A A C T G C G A A C；轉(zhuǎn)基因擬南芥中GmPIN2基因表達(dá)水平的檢測引物為Gm-F2(正向引物)：GATTTCTATGCCATGTTCGCAA，Gm-R2(反向引物)：CTCAATCAATTCGTGAACAGCT。

1.2.5GmPIN2b回補擬南芥Atpin2突變體表型和根系向重性的分析 將野生型、Atpin2突變體以及pAtPIN2::GmPIN2b轉(zhuǎn)基因株系的種子表皮滅菌后，在1/2MS固體培養(yǎng)基中萌發(fā)。待幼苗根長至1.5 cm左右，將生長一致的幼苗轉(zhuǎn)移到新的1/2MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行不同磷水平處理。其中高磷處理含 KH2PO41 250 μmol/L，低磷處理含 KH2PO425 μmol/L；培養(yǎng)箱溫度為 24 ℃；光周期為 16 h/8 h。磷處理8 d后，分析植株鮮質(zhì)量、主根長和側(cè)根數(shù)。另外，將長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移到新的1/2MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行上述磷處理，然后將培養(yǎng)皿逆時針旋轉(zhuǎn)90°放置，處理30 h后掃描植株根系，并用ImageJ(National Institutes of Health，美國)測定根系彎曲角度。每個處理設(shè)4次重復(fù)，每次重復(fù)8棵植株。

1.2.6 植物RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取約0.1～0.2 g植物鮮樣用液氮研磨，根據(jù)Trizol(Omega，美國)的說明書在樣品中加入預(yù)冷的1 mL Trizol震蕩混勻；再加入0.2 mL氯仿，震蕩混勻后，室溫靜置5 min。離心后吸取0.5 mL上清液，往上清液中加入等體積的異丙醇，冰上靜置后離心，所得的沉淀用75%(φ)乙醇溶液洗滌2次，沉淀風(fēng)干后加入無RNA酶的滅菌水溶解RNA。用分光光度計(IMPLEN，美國)測定RNA濃度，然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)說明書，合成cDNA第1鏈，反應(yīng)結(jié)束后，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 實時熒光定量 PCR 設(shè)計GmPIN2b的定量PCR引物為F(正向引物)：AATTGCATTGCCCATAA CCATACTC，R(反向引物)：ATTTCCCTTCATC CACCCCGC；大豆看家基因GmEF1a的定量PCR引物為F(正向引物)：TGCAAAGGAGGCT GCTAACT，R(反向引物)：CAGCATCACCGTT CTTCAAA和擬南芥AtEF1a的定量PCR引物為F(正向引物)：GTCGATTCTGGAAAGTCGACC，R(反向引物)：AATGTCAATGGTGATACCACGC。將所得第1鏈稀釋20倍做為定量PCR反應(yīng)模板；適量原液做梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)曲線模板。定量PCR 反應(yīng)體系：10 μL 2× Go Taq?qPCR master mix(Promega，美國)；正向引物和反向引物各 0.4 μL；2 μL 模板；0.2 μL CXR Reference；補 H2O 至 20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃15 s，72 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher，美國)攜帶的Real-Time Analysis Software 6.0 計算每個樣品的表達(dá)量。相對表達(dá)量為目的基因的表達(dá)量與看家基因表達(dá)量的比值。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 本文所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2016(Microsoft Company，美國)和IBM SPSS Statistics V21.0(IBM SPSS，美國)進(jìn)行處理及統(tǒng)計分析。利用TBtools軟件分析基因的表達(dá)模式和制作基因表達(dá)模式熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmPIN的系統(tǒng)進(jìn)化分析及組織表達(dá)模式分析

利用MEAG 5.05對大豆、水稻和擬南芥的PIN蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，擬南芥、水稻和大豆的PIN家族在進(jìn)化樹上可分為7個亞族(圖1)。其中，大豆GmPIN2a和GmPIN2b與擬南芥AtPIN2位于同一亞族，二者相似性超過90%。對SOYBASE數(shù)據(jù)庫中23個大豆GmPIN基因的組織表達(dá)水平構(gòu)建表達(dá)模式熱圖，結(jié)果(圖 2)顯示，GmPIN1e、GmPIN3b、GmPIN1a和GmPIN1c等基因在各組織部位中均有較高的表達(dá)水平；而GmPIN2b、GmPIN2a與GmPIN5b等基因在根部的表達(dá)水平較高。

圖 1 GmPIN系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of GmPIN

圖 2 GmPIN基因組織表達(dá)模式Fig. 2 Tissue expression pattern of GmPIN genes

2.2 低磷脅迫對GmPIN家族成員在大豆根系中表達(dá)模式的影響

利用已報道的大豆根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26]，對低磷調(diào)控的19個GmPIN基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果 (圖 3)表明，GmPIN9d、GmPIN8d、GmPIN8a、GmPIN2a與GmPIN2b這5個基因均受低磷脅迫上調(diào)表達(dá)，其中，低磷條件下GmPIN2b的表達(dá)量是高磷對照的 1.2倍；相反，GmPIN3d、GmPIN9b、GmPIN5a與GmPIN6b這4個基因受低磷脅迫下調(diào)表達(dá)，其中，GmPIN3d的表達(dá)水平在低磷條件下僅為高磷對照的50%；除此之外，其他GmPIN基因成員的表達(dá)水平不受低磷脅迫的影響。

圖 3 低磷脅迫下大豆根系中GmPIN基因表達(dá)模式Fig. 3 Expression pattern of GmPIN genes in soybean roots in response to low phosphorus stress

2.3 不同低磷脅迫時間對大豆生長和根系中GmPIN2b表達(dá)水平的影響

根據(jù)SOYBASE數(shù)據(jù)庫中GmPIN同源基因的組織表達(dá)模式，選取在根組織(包括根和根瘤)中均有表達(dá)的GmPIN2b作為研究對象，進(jìn)一步分析不同磷處理時間對該基因表達(dá)水平的影響。植物表型分析結(jié)果(圖4)顯示，低磷處理12和15 d后，與高磷對照相比，大豆單株鮮質(zhì)量分別降低了11%和33%(P<0.01)(圖4A)；單株總根長分別為高磷對照的1.18和1.32倍(P<0.05)(圖4B)；根冠比極顯著增加，分別為高磷對照的1.43和1.99倍(P<0.01)(圖4C)。定量PCR結(jié)果顯示，低磷處理6、12和15 d后，大豆根系中GmPIN2b的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，分別是高磷對照的4.19、1.77和1.93倍(P<0.05)(圖 4D)。

圖 4 不同低磷處理時間對大豆生長和GmPIN2b表達(dá)水平的影響Fig. 4 Soybean growth and GmPIN2b expression level in response to different periods of low phosphorus treatment

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測

將擬南芥AtPIN2啟動子與大豆GmPIN2b的編碼區(qū)融合，構(gòu)建了pAtPIN2::GmPIN2b表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥突變體Atpin2，獲得了回補表達(dá)GmPIN2b的轉(zhuǎn)基因材料。對轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因鑒定和GmPIN2b表達(dá)水平的分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因材料擴增出pAtPIN2啟動子融合GmPIN2b基因CDS的片段，表明GmPIN2b回補表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料為陽性植株(圖5)。GmPIN2b在陽性株系RA1和RA2的根系和葉片中均有較高表達(dá)水平，與野生型相比呈顯著差異(P<0.001)(圖6)。

圖 5 GmPIN2b陽性轉(zhuǎn)基因植株的檢測Fig. 5 Detection of GmPIN2b positive transgenic plants

圖 6 擬南芥回補表達(dá)株系根系和葉片中GmPIN2b的表達(dá)水平Fig. 6 Expression levels of GmPIN2b in the shoots and roots of Arabidopsis complement expression lines

2.5 回補表達(dá)GmPIN2b對轉(zhuǎn)基因擬南芥生長的影響

野生型、pAtPIN2::GmPIN2b轉(zhuǎn)基因株系和Atpin2突變體等材料的種子在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)5 d后，進(jìn)行不同磷水平的處理，8 d后對其單株鮮質(zhì)量、主根長度和側(cè)根數(shù)等進(jìn)行分析。與高磷對照相比，低磷脅迫下植株較小，主根生長均受到明顯抑制(圖7)。結(jié)果顯示，低磷條件下，無論是野生型還是轉(zhuǎn)基因材料，單株鮮質(zhì)量和主根長均比高磷對照顯著降低(P<0.001)(表1)。無論在高磷還是低磷條件下，AtPIN2基因的突變均顯著降低了擬南芥單株的鮮質(zhì)量和主根長，而回補表達(dá)GmPIN2能夠部分恢復(fù)Atpin2的鮮質(zhì)量和主根長突變表型(圖8A、8B)。其中，回補表達(dá)株系RA1和RA2的植株鮮質(zhì)量在高磷和低磷條件下分別比突變體高27%、28%和18%、16%，其主根長度分別比突變體提高33%、39%和43%、18%。另外，低磷顯著減少了擬南芥植株的一級側(cè)根數(shù)(P<0.001)(表1)。但在高磷條件下，植株一級側(cè)根數(shù)在不同材料之間無顯著差別；在低磷條件下，Atpin2突變體的一級側(cè)根數(shù)顯著低于野生型，而回補表達(dá)GmPIN2b后，轉(zhuǎn)基因株系RA1和RA2的一級側(cè)根數(shù)均比突變體顯著增加，分別為突變體的1.24和1.20倍(圖8C)。

圖 7 回補表達(dá)GmPIN2b對轉(zhuǎn)基因擬南芥生長的影響Fig. 7 Effect of GmPIN2b complement expression on growth of transgenic Arabidopsis

表 1 不同磷處理和轉(zhuǎn)基因回補表達(dá)對擬南芥生理指標(biāo)和根系向重性影響的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA of the effects of different phosphorus treatments and transgenic complement expression on Arabidopsis physiological indicators and root gravity

圖 8 回補表達(dá)GmPIN2b對轉(zhuǎn)基因擬南芥生長指標(biāo)的影響Fig. 8 Effects of GmPIN2b complement expression on growth indexes of transgenic Arabidopsis

2.6 回補表達(dá)GmPIN2b對轉(zhuǎn)基因擬南芥根系向重性的影響

將萌發(fā)了5 d、生長一致的幼苗轉(zhuǎn)移到新的1/2MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行不同磷水平處理，將培養(yǎng)皿逆時針旋轉(zhuǎn)90°放置，處理30 h后觀察擬南芥主根的彎曲角度。從擬南芥的表型可見，高磷條件下野生型根系的彎曲程度較大，突變體Atpin2較??；而低磷條件下，所有植株的根系生長均明顯受阻，但野生型根系的彎曲程度較其他根系明顯(圖9)。擬南芥根系向重性受磷處理顯著影響(P<0.05)，在轉(zhuǎn)基因回補表達(dá)株系間具有極顯著差異(P<0.001)(表1)。無論在高磷還是低磷條件下，RA1、RA2和Atpin2的主根彎曲角度均顯著小于野生型(圖10)。高磷條件下，RA1和RA2主根彎曲的角度顯著高于Atpin2，分別是Atpin2的2.33和2.10倍；而低磷條件下，回補表達(dá)株系的主根彎曲角度稍微高于Atpin2，差異不顯著 (圖 10)。

圖 9 回補表達(dá)GmPIN2b對轉(zhuǎn)基因擬南芥根系表型的影響Fig. 9 Effect of GmPIN2b complement expression on root phenotype of transgenic Arabidopsis

圖 10 回補表達(dá)GmPIN2b對轉(zhuǎn)基因擬南芥主根彎曲角度的影響Fig. 10 Effect of GmPIN2b complement expression on curvature angle of transgenic Arabidopsis

3 討論與結(jié)論

生長素作為一種重要的生長調(diào)節(jié)激素參與植物根系的生長發(fā)育[13-14]。植物生長素輸出載體PIN基因家族在介導(dǎo)植物生長素不對稱分布、調(diào)控植株形態(tài)建成的過程中起著關(guān)鍵的作用。例如，擬南芥的基因組中存在8個PIN同源基因，這些基因參與擬南芥植株發(fā)育的重要調(diào)控過程，包括調(diào)控胚和花粉的發(fā)育以及維管組織的分化[27-28]，介導(dǎo)生長素在莖尖分生組織的環(huán)流和從地上部到根系的極性運輸[27, 29-30]，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)生長素的動態(tài)平衡[28, 31]，參與根的向重性生長等[19, 32]。本研究對大豆的PIN同源基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大豆基因組中存在23個GmPIN同源基因，其中大豆GmPIN2b與擬南芥AtPIN2位于同一亞族，具有較高的相似性。AtPIN2參與了根系向地生長的調(diào)控[13-14]，但是大豆GmPIN調(diào)控根系生長和向重性的功能未見報道。因此，本研究選取與AtPIN2較為相似的GmPIN2b作為研究對象，獲得了回補表達(dá)GmPIN2b的擬南芥Atpin2突變體的轉(zhuǎn)基因材料。該轉(zhuǎn)基因材料能夠部分恢復(fù)Atpin2突變體根系向重性的表型。該結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似，例如，水稻OsPIN2可以回補突變體Atpin2主根的向重性功能缺陷，且OsPIN2的回補表達(dá)可以恢復(fù)Atpin2在向重情況下根尖生長素的極性分布[20]。GmPIN2b能夠回補Atpin2突變體的根系向重性這一結(jié)果進(jìn)一步說明了植物PIN2在調(diào)控植物根系向重性反應(yīng)的過程中具有一定的功能保守性。

早期研究表明，植物根系形態(tài)構(gòu)型的改變是植物適應(yīng)低磷脅迫的重要機制[33]。本研究顯示，低磷處理12 d后的大豆總根長高于高磷對照，這與前人的研究結(jié)果相同[12, 33]，說明低磷脅迫條件下，大豆通過促進(jìn)根系生長、提高植株根冠比，從而提高植株對外界環(huán)境磷的吸收和利用。另外，低磷脅迫顯著提高了GmPIN2b在大豆根系的表達(dá)水平，回補表達(dá)GmPIN2b能夠部分回補擬南芥Atpin2突變體的向重性。這些結(jié)果暗示了GmPIN2b介導(dǎo)的生長素不對稱分布可能參與了低磷脅迫調(diào)控大豆根系生長的過程；因此，本研究觀察了回補表達(dá)GmPIN2b的擬南芥Atpin2突變體在不同磷水平條件下根系的生長情況。研究發(fā)現(xiàn)無論高磷還是低磷條件下，與Atpin2突變體相比，回補表達(dá)GmPIN2b均明顯增加了轉(zhuǎn)基因植株的鮮質(zhì)量和主根長；尤其是低磷條件下回補表達(dá)GmPIN2b顯著提高了突變體的一級側(cè)根數(shù)。最近有研究顯示，油菜素甾醇促進(jìn)PIN2蛋白從根尖到伸長區(qū)的積累，導(dǎo)致側(cè)根數(shù)增加[19, 34]，說明PIN2蛋白也參與了側(cè)根發(fā)育的調(diào)控；因此，低磷條件下，大豆可能通過提高GmPIN2b的表達(dá)水平，改變主根尖生長素的向基運輸以及側(cè)根原基中生長素的濃度，從而參與低磷條件下側(cè)根的發(fā)育。

綜上所述，低磷脅迫提高了大豆根系中GmPIN2b的表達(dá)，回補表達(dá)該基因能夠部分回補Atpin2突變體的生物量、側(cè)根數(shù)和根系向重性；因此，GmPIN2b在根系形態(tài)建成響應(yīng)低磷脅迫的過程中可能起著重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示大豆根系適應(yīng)低磷脅迫的分子機制提供了重要的理論依據(jù)。