支氣管敗血波氏菌截短BcfA表達(dá)的重組蛋白及其免疫活性分析

朱偉峰 譚凱 王芳 程序 仇汝龍 范志宇 陳露

摘要： 為提高支氣管敗血波氏菌保護(hù)性抗原BcfA重組蛋白的表達(dá)量和可溶性，對(duì)編碼BcfA N端373位氨基酸殘基之后的BcfA基因堿基序列進(jìn)行了克隆和表達(dá)，截短后的BcfA表達(dá)量提高了10倍，且主要為可溶性表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，截短BcfA表達(dá)后的重組蛋白與支氣管敗血波氏菌感染康復(fù)血清反應(yīng)依然明顯。免疫保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果表明截短BcfA表達(dá)的重組蛋白依然對(duì)支氣管敗血波氏菌表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞： 支氣管敗血波氏菌;波氏菌黏附因子A（BcfA）;截短表達(dá);保護(hù)性抗原

中圖分類號(hào)： S858.291.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）03-0699-05

Recombinant protein expressed from BcfA in Bordetella bronchiseptica and its immune activity analysis

ZHU Wei-feng1，2，3， TAN Kai1，2，3， WANG Fang1，2，3， CHENG Xu1，2，3， QIU Ru-long1，2，3， FAN Zhi-yu1，2，3，CHEN Lu1，2，3

（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural affairs， Nanjing 210014， China;3.National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products， Nanjing 210014， China）

Abstract： To improve the expression and solubility of BcfA recombinant protein of a protective antigen against Bordetella bronchiseptica， the base sequence of BcfA gene encoding amino acid residues of the N-terminal after the 373rd position was cloned and expressed. The expression of shortened BcfA was increased by ten times， and the expression form was mainly soluble. Western blot results showed that the truncated protein encoded by BcfA still exhibited obvious reaction with convalescent serum infected by Bordetella bronchiseptica. The results of immunoprotection test showed that recombinant protein expressed from truncated BcfA still showed good immunoprotection against Bordetella bronchiseptica.

Key words： Bordetella bronchiseptica;Bordetella adhesion factor A （BcfA）;truncated expression;protective antigen

支氣管敗血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）是一種能感染多種哺乳動(dòng)物、引起動(dòng)物發(fā)生鼻炎和肺炎的革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。此菌以犬、豬及兔的感染最為普遍，常導(dǎo)致犬傳染性支氣管炎、豬傳染性萎縮性鼻炎和兔支氣管敗血波氏菌病。此外，支氣管敗血波氏菌和其他病原體之間存在協(xié)同作用，從而增加其他原發(fā)性和繼發(fā)性病原體引起的呼吸道疾病的嚴(yán)重程度，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失[1]。此外，人類也可以發(fā)生支氣管敗血波氏菌感染[2-3]。

目前已經(jīng)研制或有報(bào)道的支氣管敗血波氏菌病疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗3種。與滅活疫苗和弱毒疫苗相比，亞單位疫苗具有安全、穩(wěn)定和可以借助基因工程手段大量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，正成為獸用疫苗研究的重要方向[4-5]。支氣管敗血波氏菌的波氏菌黏附因子A（Bordetella colonization factor A， BcfA）蛋白是一種和細(xì)菌定殖有關(guān)的外膜蛋白，具有良好的免疫保護(hù)力，是支氣管敗血波氏菌亞單位疫苗研制的重要候選抗原[6-7]。但是BcfA重組蛋白的表達(dá)量不高，而且主要以包涵體形式表達(dá)，這不利于其臨床應(yīng)用。本研究的目的是通過對(duì)BcfA進(jìn)行截短表達(dá)，從而獲得一種表達(dá)量高、可溶性好、且較好地保留了原BcfA全長(zhǎng)蛋白免疫活性的重組蛋白。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及培養(yǎng)

質(zhì)粒載體pET28a（+）、基因工程宿主菌BL21 （DE3）、支氣管敗血波氏菌BJL0504（分離于患鼻炎的家兔）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院兔病團(tuán)隊(duì)保存并提供。胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）（添加10%小牛血清）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（添加4.0%小牛血清、0.2%羊血）購(gòu)自青島海博生物有限公司，用于波氏菌培養(yǎng)。LB液體或固體培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物有限公司，用于培養(yǎng)大腸基因工程宿主菌。

1.2 蛋白質(zhì)氨基酸序列分析

以GenBank公布的支氣管敗血波氏菌NCTC8344 株全基因組序列中的BcfA基因序列為參考序列進(jìn)行分析。使用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）確定信號(hào)肽序列。使用Bepipred-2.0（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）確定BcfA的B細(xì)胞表位分布情況。多序列比對(duì)使用在線軟件Clustal Omega（http：//www.clustal.org/omega/）完成，比較本試驗(yàn)所用的BcfA蛋白氨基酸序列和NCTC8344 株參考序列之間的相似性。

1.3 BcfA基因的克隆

以支氣管敗血波氏菌NCTC8344 株的BcfA基因序列為參考序列，設(shè)計(jì)引物373T-F（CAGCAAATGGGTCGCGGATCCACGATCGCGCGCGTCGATAC，字母下有橫線的為與載體相同的同源臂，下同）和373T-R（GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTCCCA￣G￣C￣A￣G￣G￣C￣C￣GCCCTC）擴(kuò)增截短的BcfA堿基序列，45Q-F（ CAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAGGGG￣G￣C￣G￣C￣C￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣C）和45Q-R（GCAAGCTTGTCGA￣C￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣C￣T￣C￣C￣C￣A￣G￣CAGGCCGCCCTC）擴(kuò)增成熟的全長(zhǎng)BcfA堿基序列。使用試劑盒[8]提取支氣管敗血波氏菌BJL0504菌株全基因組DNA模板。然后對(duì)目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Ban H I和Hind III限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒后按照試劑盒（南京諾唯贊公司產(chǎn)品）說明書的要求進(jìn)行同源重組連接，將BcfA的PCR擴(kuò)增DNA片段連接到質(zhì)粒載體PET28a（+）上。待重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）宿主工程菌以后，將PCR鑒定的陽(yáng)性克隆送至南京擎科公司測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證連接的正確性及所克隆基因的完整性。

1.4 表達(dá)、純化及鑒定

對(duì)BcfA工程菌進(jìn)行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化誘導(dǎo)條件，包括比較不同IPTG濃度（0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L）的誘導(dǎo)效果和比較不同溫度（16 ℃、28 ℃、37 ℃）下的誘導(dǎo)表達(dá)效果。對(duì)過夜誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌使用超聲波裂解破碎，然后高速離心并分別收集裂解液上清液和包涵體沉淀，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠染色以檢測(cè)表達(dá)效果。按照Ni磁珠（南京金斯瑞公司產(chǎn)品）說明書的要求操作，使用250 mmol/L咪唑洗脫純化目的重組蛋白。通過Bradford法測(cè)定純化后的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)而估測(cè)重組蛋白表達(dá)量。

1.5 BcfA重組蛋白與支氣管敗血波氏菌感染康復(fù)血清反應(yīng)的檢測(cè)

將BcfA重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后再轉(zhuǎn)到NC膜上。使用5%的脫脂乳過夜封閉后，加入由實(shí)驗(yàn)室提前制備并保存的BJL0504株兔感染康復(fù)血清（1/500），于37 ℃下孵育1 h。經(jīng)過磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）徹底漂洗后，在37 ℃下孵育HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG（1/10 000）1 h。最后經(jīng)過PBST徹底洗滌以后，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色。

1.6 小鼠免疫與血清抗體檢測(cè)

取30 只4～6 周齡 C57BL/6雌鼠，隨機(jī)分成3組，1組對(duì)照，2組試驗(yàn)，每組 10 只。試驗(yàn)組分別免疫BcfA截短重組蛋白（BcfA-373T）和BcfA全長(zhǎng)重組蛋白（BcfA-45Q）。試驗(yàn)組首次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑，2次免疫間隔21 d。抗原劑量為每只100 μg。對(duì)照組使用PBS代替重組蛋白，其他處理與試驗(yàn)組相同。所有小鼠于第2次免疫10 d后采集制備小鼠血清，測(cè)定抗體產(chǎn)生情況。以純化的BcfA重組蛋白包被ELISA板（每孔1 μg），37 ℃孵育2 h，徹底洗滌3次以后，使用5%的脫脂乳于37 ℃下封閉1 h，然后37 ℃下孵育待檢血清（1/200）1 h，以PBST徹底洗滌后37 ℃下孵育HRP偶聯(lián)的羊抗鼠二抗30 min，經(jīng)過5遍洗滌以后加入100 μl TMB單組分顯色液（湖州英創(chuàng)公司產(chǎn)品）顯色并讀數(shù)。

1.7 攻毒試驗(yàn)

ELISA檢測(cè)確認(rèn)特異性抗體產(chǎn)生后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[6]的方法開展試驗(yàn)，僅做少量必要的修改。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的支氣管敗血波氏菌菌液按照每只1.5×107CFU（35 μl）的劑量對(duì)小鼠滴鼻攻毒，攻毒7 d后的小鼠脫頸椎處死，無(wú)菌解剖取出肺臟，使用組織研磨儀充分研磨肺臟組織后，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算每只小鼠的肺臟組織載菌量。并對(duì)肺臟內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)觀察和PCR鑒定[8]。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。用t檢驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，差異顯著判定標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 BcfA重組蛋白的信號(hào)肽與B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

BcfA一級(jí)結(jié)構(gòu)共包含969個(gè)氨基酸殘基。SignalP5.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明BcfA的N端前44個(gè)氨基酸殘基屬于信號(hào)肽序列，故成熟的BcfA全長(zhǎng)從第45個(gè)氨基酸殘基（Q）開始，本研究所表達(dá)的BcfA全長(zhǎng)重組蛋白即是從第45個(gè)氨基酸殘基開始的，記為BcfA-45Q。選擇Bepipred-2.0軟件默認(rèn)的0.5作為氨基酸殘基構(gòu)成表位的閾值，預(yù)測(cè)結(jié)果表明BcfA的表位主要分布于C端，特別是后600個(gè)氨基酸殘基序列（圖1）。本研究選擇了重組表達(dá)373T以后的BcfA（稱為BcfA-373T）。連接產(chǎn)物測(cè)序和多序列比對(duì)結(jié)果表明本研究所克隆的BJL0504株BcfA基因序列與參考菌株NCTC8344的BcfA基因序列完全相同。使用在線軟件Bepipred-2.0（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）預(yù)測(cè)分值高于0.5構(gòu)成B細(xì)胞表位的幾率較大。

2.2 BcfA重組蛋白的截短表達(dá)效果

將BcfA基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21基因工程大腸桿菌后，通過各種誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，選用0.5 mmol/L IPTG、37 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到表達(dá)量較高的BcfA重組蛋白。截短BcfA的表達(dá)量顯著增加，而且主要為可溶性表達(dá)，易于進(jìn)行純化（圖2A、圖2B）。全長(zhǎng)BcfA表達(dá)的重組蛋白（BcfA-45Q）的表達(dá)量約為0.03 mg/ml，而截短BcfA表達(dá)的重組蛋白（BcfA-373T）的表達(dá)量約為0.30 mg/ml，即與全長(zhǎng)BcfA的表達(dá)量相比截短BcfA的表達(dá)量提高了10倍左右。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，BcfA-373T泳道存在1條相對(duì)分子質(zhì)量為6.7×104左右的條帶（圖2C），這表明截短BcfA表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠與支氣管敗血波氏菌感染康復(fù)血清反應(yīng)，即截短表達(dá)后依然保留著BcfA的反應(yīng)原性。

2.3 截短重組蛋白免疫后血清抗體水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示加強(qiáng)免疫10 d后全長(zhǎng)BcfA重組蛋白（BcfA-45Q）免疫組和截短BcfA重組蛋白（BcfA-373T）免疫組均產(chǎn)生了高水平的特異性抗體（圖3A）。攻毒后的檢測(cè)結(jié)果表明BcfA-373T免疫組和BcfA-45免疫組小鼠肺臟內(nèi)的支氣管敗血波氏菌數(shù)量都僅平均為約每只10 CFU，二者差異不顯著，均顯著低于對(duì)照組小鼠肺臟內(nèi)的支氣管敗血波氏菌數(shù)量（平均每只約1×105CFU）（圖3B）。

3 討論

盡管目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了BcfA、PRN、FHA、DNT等保護(hù)性抗原[9-10]，但這些保護(hù)性抗原的重組蛋白表達(dá)量不高，且主要表達(dá)形式都是包涵體，需要溶解復(fù)性后才能起到保護(hù)性抗原的作用，這會(huì)增加生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本。目前已經(jīng)有多種保護(hù)性抗原通過截短表達(dá)提升了表達(dá)量和可溶性[11-12]。故本研究在分析BcfA各個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成B細(xì)胞表位能力的基礎(chǔ)上對(duì)BcfA進(jìn)行截短表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明截短后的BcfA表達(dá)量提升了10倍左右，并且以可溶性表達(dá)為主。截短后的BcfA重組蛋白與支氣管敗血波氏菌感染康復(fù)血清反應(yīng)依然明顯，這表明截短表達(dá)的重組蛋白BcfA-373T較好地保留了原蛋白質(zhì)的免疫原性。

在此前的文獻(xiàn)報(bào)道中有的學(xué)者曾經(jīng)采用腹腔注射攻毒而后觀察小鼠死亡率的方法評(píng)估保護(hù)性抗原的效力[13-14]?？紤]到支氣管敗血波氏菌引發(fā)的動(dòng)物疫病主要表現(xiàn)為呼吸道局部感染，如豬的傳染性萎縮性鼻炎、家兔傳染性鼻炎和肺炎、犬傳染性支氣管炎等[1]，我們認(rèn)為通過呼吸道攻毒并評(píng)估攻毒后小鼠肺臟的載菌量能夠更好地模擬自然感染并更好地反映保護(hù)性抗原對(duì)局部感染的免疫保護(hù)作用，所以我們采用了滴鼻攻毒的方式，這將使試驗(yàn)結(jié)果更具有參考意義。通過呼吸道攻毒也是很多學(xué)者采用的一種支氣管敗血波氏菌攻毒方式[15-16]。

截短的BcfA（BcfA-373T）免疫組的組織載菌量顯著低于對(duì)照組，這表明截短的BcfA具有很好的免疫保護(hù)力。BcfA-373T與BcfA-45Q免疫組的組織載菌量差異不顯著，且與已有報(bào)道[4]一致。所以應(yīng)該認(rèn)為截短后的BcfA依然保留著全長(zhǎng)BcfA的免疫活性，可以用于后續(xù)的疫苗研究。

總之，本研究通過截短表達(dá)提高了BcfA重組蛋白的表達(dá)量和可溶性，為后期研制以BcfA重組蛋白抗原為基礎(chǔ)的基因工程疫苗提供了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：張震林）