一株豬丹毒絲菌的全基因組測序及SpaA基因分析

彭凌 林錦銓 李玲慧 劉博婷 蔡鞏林

摘要： 本研究測定豬丹毒絲菌臨床毒株SG7的全基因組序列，并運用生物信息學(xué)方法對測定的全基因組序列及豬丹毒絲菌表面保護性抗原A基因（SpaA）進行分析。SG7菌株的基因組全長為1 834 291.00 bp，G+C含量為36.3%，基因總數(shù)1 846個。將SG7菌株與GenBank中8條完整的豬丹毒絲菌全基因組序列進行比較，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外不同菌株間基因組的基本信息存在不同程度差異?；谌蚪M單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，9株菌株聚為3個分支，國內(nèi)菌株并不完全處于同一分支，SG7菌株與國內(nèi)常見菌株不屬于同一進化分支。SpaA基因高變區(qū)的分析結(jié)果顯示，9株菌株亦可分為3個SpaA型，SG7菌株為攜帶Met203的高致病性菌株。除SG7菌株外，其他8株菌株的SpaA基因分型結(jié)果與基于全基因組SNPs分析的結(jié)果一致，說明SG7菌株的遺傳背景復(fù)雜。本研究結(jié)果可為豬丹毒絲菌基因組整體水平研究和疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 豬丹毒絲菌;全基因組測序;表面保護性抗原A（SpaA）

中圖分類號： S852.61 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0694-05

Whole-genome sequencing and SpaA gene analysis of a Erysipelothrix rhusiopahiae strain

PENG Ling， LIN Jin-quan， LI Ling-hui， LIU Bo-ting， CAI Gong-lin

（Henry Fok College of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan 512005， China）

Abstract： In this study， the whole genome sequence of Erysipelothrix rhusiopahiae clinical strain SG7 was determined， and the whole genome sequence and the surface protective antigen A （SpaA）gene were analyzed using bioinformatics method. The full length of SG7 genome was 1 834 291.00 bp， and the total quantity of the predicted genes were 1 846 with a G+C content of 36.3%. Different degrees of differences of genomic basic information between different strains were found by comparing the complete genome sequences of SG7 and eight E. rhusiopahiae found in GenBank. Phylogenetic analysis based on genome-wide single nucleotide polymorphisms （SNPs） revealed that nine strains could be clustered into three distinct clades， and strains isolated from China were not in the same clade， while SG7 and common strains isolated from China did not belong to the same clade. The analysis results of hypervariable region of SpaA showed that nine strains could also be divided into three SpaA types， and SG7 was a highly pathogenic strain carrying Met203. Except for SG7， the SpaA genotyping results of other eight strains were consistent with the analytic results obtained based on the genome-wide SNPs analysis， which indicated that the genetic background of SG7 was complex. The results can provide data basis for the research at the whole genome level and development of E. rhusiopahiae vaccine.

Key words： Erysipelothrix rhusiopahiae;whole-genome sequencing;surface protective antigen A （SpaA）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopahiae）又稱紅斑丹毒絲菌，屬于丹毒絲菌屬（Erysipelothrix），呈纖細(xì)桿狀，是一種革蘭氏陽性的人畜共患病病原菌。豬丹毒是由豬丹毒絲菌引發(fā)的一種急性、熱性傳染病，能導(dǎo)致家禽、畜類的一系列皮膚感染及敗血癥。人類因外傷局部感染豬丹毒絲菌，會發(fā)生類丹毒，感染時手指出現(xiàn)斑點或腫起[1-2]。在20世紀(jì)80至90年代，豬丹毒與豬肺疫、豬瘟并稱中國養(yǎng)豬業(yè)三大傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失并影響人類健康[3]。近年來，豬丹毒在中國多個省份均有發(fā)生，且發(fā)病率呈上升趨勢[4]。

目前預(yù)防和控制豬丹毒疫病的主要手段是接種疫苗，傳統(tǒng)疫苗雖然對豬丹毒的預(yù)防起到一定作用，但仍有保護率低、保護周期短等缺點。細(xì)菌的毒力因子是人們研制新型疫苗的標(biāo)靶[5]。有研究結(jié)果表明，豬丹毒絲菌表面保護性抗原A（SpaA）是其重要的毒力因子[6-7]，可以通過介導(dǎo)豬丹毒絲菌與豬內(nèi)皮細(xì)胞的黏附而侵入宿主發(fā)揮作用[7]。同時亦有很多研究結(jié)果證實了SpaA蛋白的N端區(qū)域為免疫保護區(qū)，對豬丹毒絲菌毒株有良好的免疫保護作用[8-10]。全基因組測序是通過DNA測序儀對物種基因進行測序的一種生物信息學(xué)手段，全基因組測序分辨率高、分析速度快，為傳染性疾病的調(diào)查提供了新的方法，對疫病監(jiān)測具有重要的指導(dǎo)意義[11]。本研究擬通過測定分離自廣東省韶關(guān)市的豬丹毒絲菌毒力菌株SG7[12]的全基因序列，利用相關(guān)軟件進行全基因組的注釋分析，并分析SpaA的遺傳多樣性，以期為豬丹毒絲菌的后續(xù)研究提供有利的數(shù)據(jù)支撐，也為新型亞單位疫苗的開發(fā)和改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

從廣東省韶關(guān)市某豬丹毒發(fā)病豬場分離獲得豬丹毒絲菌菌株SG7，通過動物試驗鑒定為毒力菌株，半致死量（LD50）為7.3×103CFU[12]。

1.2 基因組的測序與注釋

將得到的豬丹毒絲菌DNA樣品進行Illumina HiseqTM測序，獲得原始圖像數(shù)據(jù)，再經(jīng)過堿基識別得到原始測序數(shù)據(jù)。但鑒于Illumina測序過程中產(chǎn)生的錯誤會對最終的分析結(jié)果造成影響，為了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，通過軟件FastQC對測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進行可視化評估，再利用軟件Trimmomatic[13]過濾原始數(shù)據(jù)，以保證信息分析的準(zhǔn)確性。使用軟件SPAdes[14]對得到的測序數(shù)據(jù)進行拼接，然后對拼接得到的重疊群進行填補空隙。在修正拼接過程中，產(chǎn)生剪輯錯誤及小片段插入缺失會影響分析的準(zhǔn)確性，因此需要采用軟件PrInSeS-G[15]進行序列矯正，得到最終的結(jié)果。拼接結(jié)果采用軟件Prokka[16]進行基因元件的分析預(yù)測，同時利用軟件RepeatModeler鑒定SG7基因組上的重復(fù)序列。最后，采用軟件NCBI Blast+將蛋白質(zhì)氨基酸序列與COG、KEGG、VFDB等數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行比對，獲得蛋白質(zhì)功能注釋信息。

1.3 SpaA基因堿基序列分析

從測定的SG7菌株以及GenBank上公布的豬丹毒絲菌全基因組序列中提取SpaA基因堿基序列，并翻譯為氨基酸序列，根據(jù)前人描述的方法[17-18]分析SpaA基因432 bp高變區(qū)對應(yīng)蛋白質(zhì)N端的氨基酸序列。

1.4 SG7菌株與其他豬丹毒絲菌的比較基因組學(xué)分析

對SG7菌株與GenBank上公布的豬丹毒絲菌完整的全基因組序列進行比較基因組學(xué)分析，并構(gòu)建基于全基因組單核苷酸多態(tài)性（SNPs）系統(tǒng)進化樹圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬丹毒絲菌菌株SG7基因組的基本特征

表1顯示，豬丹毒絲菌菌株SG7的基因組全長為1 834 291.00 bp，G+C含量為36.30%。組分分析發(fā)現(xiàn)，基因總數(shù)為1 846個，堿基數(shù)為1 685 442.00個，基因平均長度為913.02 bp，占基因組全長的91.89%，蛋白質(zhì)預(yù)測數(shù)為1 755個。采用軟件Aragorn預(yù)測tRNA，預(yù)測數(shù)為55個，采用軟件RNAmmer預(yù)測rRNA，預(yù)測數(shù)為3個。利用軟件RepeatModeler對重復(fù)序列進行預(yù)測，SG7菌株共有107個平均長度為170.30 bp的重復(fù)序列，其中DNA重復(fù)元件有19個，低復(fù)雜度序列有12個，微衛(wèi)星DNA序列有76個。

2.2 豬丹毒絲菌菌株SG7全基因組的注釋

在豬丹毒絲菌菌株SG7已經(jīng)預(yù)測的1 755個基因中，有1 316個基因注釋到COG數(shù)據(jù)庫中[19]，占預(yù)測基因的74.99%，將這些基因信息依據(jù)COG分類標(biāo)準(zhǔn)進行分類，可分為19類;有1 079個基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中[20]，占預(yù)測基因的61.48%，可將這些基因劃分為24類代謝通路。

VFDB[21]是專門用于研究致病因子的數(shù)據(jù)庫，包括SetA和SetB 2部分。將豬丹毒絲菌菌株SG7預(yù)測得到的基因堿基序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列與VFDB數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，把基因和其相對應(yīng)的毒力因子功能注釋信息結(jié)合起來，有108個基因注釋到SetA數(shù)據(jù)庫，有114個基因注釋到SetB數(shù)據(jù)庫。

CARD[22]是耐藥基因數(shù)據(jù)庫，能為藥物作用研究以及環(huán)境治理提供研究依據(jù)。將豬丹毒絲菌菌株SG7預(yù)測得到的基因堿基序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列與CARD數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，有23個基因注釋到CARD數(shù)據(jù)庫。

PHI-base[23]是病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫，用于尋找藥物干預(yù)的靶基因。將豬丹毒絲菌菌株SG7預(yù)測得到的基因堿基序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列與PHI-base數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，有34個基因注釋到PHI-base數(shù)據(jù)庫。

2.3 豬丹毒絲菌SpaA基因分析

當(dāng)前GenBank上公布的豬丹毒絲菌完整基因組序列共有8條，從SG7和GenBank中的8株豬丹毒絲菌的基因組序列中提取SpaA基因432 bp高變區(qū)，并對相應(yīng)蛋白質(zhì)的N端進行分析，結(jié)果表明，9個菌株中有5個菌株為Met203/Ile257型，3個菌株為Ile203/Ile257型，1個菌株為Ile203/Leu257型。

2.4 SG7菌株與其他豬丹毒絲菌全基因組的比較分析

將SG7菌株與GenBank中8株豬丹毒絲菌菌株的全基因組基本信息進行比較，結(jié)果（表2）顯示，豬丹毒絲菌全基因組長度為1 752 910～1 945 690 bp，G+C含量維持在36.3%～36.6%，基因數(shù)保持在1 708～1 915個，而蛋白質(zhì)數(shù)為1 390～1 801個，表現(xiàn)出較大差異;tRNA保持在55個左右，但不同菌株中的rRNA數(shù)量差異較大，SG7的rRNA僅為3個，數(shù)量遠低于其他菌株。9個菌株的共有基因為1 234個，特有基因為193個。

將上述8株菌株與SG7菌株的全基因組進行比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹圖（圖1），該進化樹含有3個分支，SG7菌株與英國分離株NCTC8163、韓國分離株KC-Sb-R1、中國南京分離株SY1027同處一個分支;而其他4個國內(nèi)分離株處于第二分支;日本分離株Fujisawa單獨為一個分支。

3 討論

豬丹毒作為一種人畜共患病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失并影響人類健康，該病的主要預(yù)防手段是疫苗接種，但傳統(tǒng)滅活疫苗存在免疫效果不持久，不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫等局限性[24]。豬丹毒的藥物治療大多采用β-內(nèi)酰胺類抗生素，但過分依賴抗生素，會導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)以及藥物殘留的風(fēng)險[25-27]，有地區(qū)就曾分離出豬丹毒絲菌青霉素耐藥菌株[28]。因此，開發(fā)更為有效的亞單位疫苗是科學(xué)防控豬丹毒的關(guān)鍵。盡管從1876年首次分離該菌至今已經(jīng)過去了100多年，但我們對豬丹毒絲菌分子機制的了解仍然十分有限[29-30]。2011年德國北部暴發(fā)大腸桿菌疫情，造成數(shù)千人感染，數(shù)十人死亡，但病原菌株的病原培養(yǎng)特性和細(xì)菌多位點序列分型（MLST）分析結(jié)果均與腸出血性大腸桿菌菌株相差甚遠，有學(xué)者懷疑是新型的致病性大腸桿菌，經(jīng)過全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與腸聚集性大腸桿菌的親緣關(guān)系更為接近，在進化上處于同一分支，但在進化過程中獲得了志賀毒素編碼基因stx2及多種耐藥基因，使其獲得了更強的生存能力，造成了病原菌的廣泛傳播[31]?？梢?，全基因組分析對病原菌株的監(jiān)測以及遺傳變異檢測有很大幫助，全基因組測序為我們從分子水平研究豬丹毒絲菌提供了便利。

本研究測定了豬丹毒絲菌菌株SG7臨床毒株[12]全基因組序列，并通過使用相關(guān)的生物信息學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫對其進行注釋，揭示了該菌株的基因組結(jié)構(gòu)特征，豐富了豬丹毒絲菌的基因組數(shù)據(jù)庫。將SG7與GenBank上公布的8株豬丹毒絲菌完整基因組序列的基本信息進行比較，除tRNA數(shù)和G+C含量比較一致外，基因組長度、基因數(shù)、蛋白質(zhì)數(shù)、rRNA數(shù)SG7菌株與國內(nèi)外其他菌株存在不同程度的差異，這也許與不同地區(qū)飼養(yǎng)管理以及環(huán)境因素等存在差異有關(guān)?；谌蚪MSNPs的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，9株菌株聚為3個分支，這與Forde等[32]、Ogawa等[18]的研究結(jié)果一致。國內(nèi)菌株并不完全處于同一分支，SG7菌株與南京分離株SY1027、英國分離株NCTC8163、韓國分離株KC-Sb-R1為同一個分支，而南寧分離株GXBY-1、成都分離株ZJ、武漢分離株WH13013、長沙分離株ML101這4個國內(nèi)分離株則為另一分支，說明國內(nèi)菌株至少有2個不同的進化途徑，SG7菌株與英國分離株NCTC8163關(guān)系最近。SpaA高變區(qū)的氨基酸序列分析結(jié)果表明，9株菌株可分為3個SpaA型，SG7菌株和南寧分離株GXBY-1、成都分離株ZJ、武漢分離株WH13013、長沙分離株ML101均為Met203/Ile257型。Uchiyama等[17]認(rèn)為攜帶Met203的分離株為高致病性菌株。Ogawa等[18]對分離自日本的34株菌株進行分析，結(jié)果表明這些菌株的SpaA基因分型結(jié)果與基于全基因組SNPs分析獲得的分類結(jié)果是一致的，本研究中除SG7菌株外，其他8個菌株亦如此。與SG7菌株處同一分支的其他菌株均為Ile203/Ile257型，SG7菌株為攜帶Met203的高致病性菌株（LD50為7.3×103CFU），但它與攜帶Met203的其他菌株不處于同一進化分支，因此推測SG7菌株在進化過程中也許與攜帶Met203的進化分支的菌株接觸后進行了SpaA基因的重組交換。本研究結(jié)果為豬丹毒絲菌基因組整體水平研究和亞單位疫苗的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] GORBY G L， PEACOCK J E. Erysipelothrix rhusiopathiae endocarditis： microbiologic， epidemiologic， and clinical features of an occupational disease[J]. Reviews of Infectious Diseases， 1988， 10（2）： 317-325.

[2] WANG Q， CHANG B J， RILEY T V. Erysipelothrix rhusiopathiae [J].Veterinary Microbiology， 2010， 140（3/4）：405-417.

[3] 周緒斌，丹 尼，李 聰，等. 豬丹毒——古老的傳染病是否從中國規(guī)?；i場消失了？[J].今日養(yǎng)豬業(yè)，2009（5）：22-24.

[4] 李文春，楊仕標(biāo)，李富祥. 一株豬丹毒桿菌的分離鑒定及SpaA基因序列分析[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2020（3）：9-12.

[5] 周作勇，李和賢，楊浩鉞，等. 偽結(jié)核棒狀桿菌毒力因子的研究進展[J].中國人獸共患病學(xué)報， 2017，33（12）：1115-1119.

[6] BORRATHYBAY E， GONG F J， ZHANG L， et al. Role of surface protective antigen A in the pathogenesis of Erysipelothrix rhusiopathiae strain C43065[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology， 2015， 25（2）：206-216.

[7] HARADA T， OGAWA Y， EGUCHI M， et al. Phosphorylcholine and SpaA， a choline-binding protein， are involved in the adherence of Erysipelothrix rhusiopathiae to porcine endothelial cells， but this adherence is not mediated by the PAF receptor[J]. Veterinary Microbiology， 2014， 172 （1/2）：216-222.

[8] 吾魯木汗·那孜爾別克，張 磊，何 翠，等. 豬丹毒絲菌天然SpaA和重組SpaA-N免疫保護效果的評價[J].微生物學(xué)報， 2010，50（3）：367-372.

[9] 姚焱彬，陸 萍，楊志鵬，等. 豬丹毒絲菌SpaA基因原核表達及表達蛋白質(zhì)的免疫原性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2017，48（3）：492-500.

[10]蔣志瓊，鐘澤民，譚博敏，等. 丹毒絲菌SpaA基因免疫保護區(qū)的克隆及其在畢赤酵母中的表達[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，36（3）：20-25.

[11]周江林，彭小川，胡明達，等. 基于全基因組測序的細(xì)菌進化研究進展[J].生物技術(shù)通訊，2018， 29（6）：844-850.

[12]周 迪，楊旭夫，彭 凌. 紅斑丹毒絲菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2020，41（2）：33-38.

[13]BOLGER A M， LOHSE M， USADEL B. Trimmomatic： a flexible trimmer for Illumina sequence data[J]. Bioinformatics， 2014，30（15）：2114-2120.

[14]BANKEVICH A， NURK S， ANTIPOV D， et al. SPAdes： a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing[J]. Journal of Computational Biology， 2012，19（5）：455-477.

[15]MASSOURAS A， HENS K， GUBELMANN C， et al. Primer-initiated sequence synthesis to detect and assemble structural variants[J]. Nature Methods， 2010，7（7）：485-486.

[16]SEEMANN T. Prokka： rapid prokaryotic genome annotation[J]. Bioinformatics， 2014，30（14）：2068-2069.

[17]UCHIYAMA M， YAMAMOTO K， OCHIAI M， et al. Prevalence of Met-203 type SpaA variant in Erysipelothrix rhusiopathiae isolates and the efficacy of swine erysipelas vaccines in Japan[J].Biologicals，2014，42（2）：109-113.

[18]OGAWA Y， SHIRAIWA K， OGURA Y， et al. Clonal lineages of Erysipelothrix rhusiopathiae responsible for acute swine erysipelas in Japan identified by using genome-wide single nucleotide polymorphism analysis [J]. Applied & Environmental Microbiology， 2017， 83（11）： e00130-17.

[19]TATUSOV R L， GALPERIN M Y， NATALE D A， et al. The COG database： a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution[J]. Nucleic Acids Research，2000， 28（1）：33-36.

[20]KANEHISA M， GOTO S. KEGG： kyoto encyclopedia of genes and genomes[J]. Nucleic Acids Research， 2000，28 （1）：27-30.

[21]CHEN L， ZHENG D， LIU B， et al. VFDB 2016： hierarchical and refined dataset for big data analysis-10 years on[J]. Nucleic Acids Research， 2016， 44：D694-D697.

[22]MCARTHUR A G， WAGLECHNER N， NIZAM F， et al. The comprehensive antibiotic resistance database[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2013， 57（7）：3348-3357.

[23]URBAN M， PANT R， RAGHUNATH A， et al. The pathogen-host interactions database （PHI-base）： additions and future developments[J]. Nucleic Acids Research， 2015， 43：D645-D655.

[24]姚焱彬. 豬丹毒絲菌滅活疫苗的制備及其對小鼠的免疫效力研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[25]張 珍，施開創(chuàng)，王孝德，等. 2015-2017年廣西雞源沙門氏菌耐藥性與致病性的相關(guān)性分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，50（10）：2350-2358.

[26]徐重新，劉 敏，張 霄，等. 農(nóng)藥危害風(fēng)險及其殘留檢測用廣譜特異性抗體研究進展[J] .江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，35（2）：489-496.

[27]王志芳，雷 燕，肖 俊，等. 廣西羅非魚主產(chǎn)區(qū)養(yǎng)殖池塘抗生素殘留狀況分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，50（4）：891-897.

[28]胡曉芬，王 靜，熊劍鋒，等. 一起豬丹毒桿菌病例的臨床分離鑒定及診治[J].養(yǎng)豬，2014（2）：107-109.

[29]王力波. 豬丹毒絲菌廣西分離株生物學(xué)特性研究及其基因組生物信息學(xué)分析[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[30]曹文堯. 丹毒絲菌表面保護抗原A作為重組亞單位疫苗和核酸疫苗的初步研究[D].烏魯木齊：新疆大學(xué)，2007.

[31]CUI Y， LI D， YANG R. Shiga toxin-producing Escherichia coli O104∶H4：an emerging important pathogen in food safety[J]. Chinese Science Bulletin， 2013， 58（14）：1625-1631.

[32]FORDE T， BIEK R， ZADOKS R， et al. Genomic analysis of the multi-host pathogen Erysipelohrix rhusiopathiae reveals extensive recombination as well as the existence of three generalist clades with wide geographic distribution[J]. BMC Genomics， 2016， 461（17）：1-15.

（責(zé)任編輯：王 妮）