血清miR-26b、miR-222表達與阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能損害的關(guān)系＊

林瑞典 張輝

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease）隨著社會老齡化的進程發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重危害人們的健康[1]。研究報道，miRNA在許多疾病中調(diào)節(jié)著神經(jīng)細(xì)胞的增殖與分化等過程，對認(rèn)知功能具有一定的影響[2]。大量研究表明，人體血清中有許多種miRNA的表達，當(dāng)人體患有疾病時，miRNA表達存在差異顯著，可以用作疾病早期診斷的潛在標(biāo)記[3-4]。研究表明，miR-26b的上調(diào)可以誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡[5]。目前，阿爾茨海默病患者血清中miR-26b和miR-222的表達特點還沒有明確的結(jié)論，本研究分析了miR-26b、miR-222的表達水平及其與患者簡明精神狀態(tài)量表（MMSE）評分的關(guān)系，探討其與阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能損害程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月-2019年12月本院收治的確診阿爾茨海默病患者86例（觀察組），同期進行健康體檢的志愿者90例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）阿爾茨海默病患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[6]美國國立神經(jīng)病、語言疾病、卒中研究所與阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會（NINCDS-ADRDA）標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡≥60歲；（3）對照組為健康體檢的志愿者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有惡性腫瘤；（2）因腦血管疾病引起的認(rèn)知功能障礙；（3）伴有其他類型精神疾?。ㄒ钟舭Y、焦慮癥等）；（4）既往具有顱腦外傷病史、顱腦手術(shù)病史。觀察組年齡60～86歲，平均（72.2±5.6）歲；男48例，女38例。對照組，年齡60～85歲，平均（71.8±6.0）歲；男45例，女45例。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；颊咧橥?，簽署知情同意書。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定（醫(yī)學(xué)倫理委員會文件：院倫辦[2017]9號）。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-26b、miR-222檢測方法 熒光定量PCR檢測miR-26b和miR-222的表達水平：使用RNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號：DP443，購自北京天根生化有限公司）對患者總血清RNA進行提取，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。目的基因擴增：使用定量PCR儀器（型號：CFX96，購自美國Bio-Rad）對miR-26b和miR-222進行擴增。定量檢測：設(shè)置qRTPCR反應(yīng)系統(tǒng)總量為10 μl：其中有5 μl iScriptSYBR?Green Mix、1 μl DNA（濃度為 50 ng/μl），濃度為 10 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μl，3.0 μl dH2O。反應(yīng)條件：95 ℃，90 s；95 ℃，30 s；63 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 個周期。以 U6 作為內(nèi)參，miR-26b和miR-222表達水平使用2-ΔΔCT方法來定量。

1.2.2 其他指標(biāo)檢測 檢測兩組患者的收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。采集患者5 ml的空腹靜脈血，在室溫條件下以3 500 r/min的速度離心15 min，分離上層血清保存于EP管中，于-80 ℃冰箱中保存待測。TG、TC、LDL-C、HDL-C水平使用全自動生化分析儀進行測定；采用己糖激酶法測定FPG水平；所有樣品均由檢驗部門中同一批人員在同一臺儀器上進行測試，每個樣品設(shè)置為重復(fù)3次。使用汞柱式標(biāo)準(zhǔn)袖帶血壓計測量血壓，所有受試者靜坐至少15 min，然后測量右上臂的血壓。將Korotkoff的第1和第5音分別用作SBP和DBP的結(jié)果，進行3次連續(xù)測量，每次間隔2 min，測3次取平均讀數(shù)。

簡明精神狀態(tài)量表（MMSE）評分：定向力（10分）、注意力和計算力（5分）、記憶力（3分）、回憶能力（3分）、語言能力（9分），總分為30分，MMSE得分≥27分為正常[7]。在安靜環(huán)境中采用MMSE進行認(rèn)知功能的評估。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 21.0軟件，兩組血清miR-26b、miR-222表達水平及MMSE評分等計量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受教育年限、血壓、血脂、血糖指標(biāo)比較

觀察組和對照組的受教育年限、SBP、DBP、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組的受教育年限、血壓、血脂、血糖指標(biāo)比較 （±s）

表1 兩組的受教育年限、血壓、血脂、血糖指標(biāo)比較 （±s）

LDL-C（mmol/L）觀察組（n=86） 10.55±2.64 136.43±8.50 76.44±7.52 5.32±0.64 1.84±0.40 4.96±0.51 1.20±0.18 2.82±0.58對照組（n=90） 10.32±3.01 134.71±7.83 77.26±7.60 5.40±0.58 1.91±0.38 5.12±0.58 1.25±0.20 2.76±0.55 t值 0.538 1.397 -0.719 -0.870 -1.191 -1.940 -1.741 0.704 P值 0.591 0.164 0.473 0.386 0.235 0.054 0.084 0.482組別 受教育年限（年）SBP（mm Hg）DBP（mm Hg）FPG（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）

2.2 兩組血清miR-26b、miR-222表達水平及MMSE評分比較

觀察組的血清miR-26b、miR-222表達水平及MMSE評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組血清miR-26b、miR-222表達水平及MMSE評分比較（±s）

表2 兩組血清miR-26b、miR-222表達水平及MMSE評分比較（±s）

組別 miR-26b miR-222 MMSE評分（分）觀察組（n=86） 0.634±0.153 0.681±0.177 20.51±1.95對照組（n=90） 1.027±0.225 0.984±0.205 28.05±1.08 t值 -13.489 -10.474 -31.918 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 相關(guān)性分析

阿爾茨海默病患者的血清miR-26b、miR-222表達水平與MMSE評分均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見表3。

表3 miR-26b、miR-222表達水平與MMSE評分線性相關(guān)分析

3 討論

阿爾茨海默病是老年人經(jīng)常發(fā)生的疾病，其發(fā)病機制仍不清楚。最近的研究表明，多種miRNA表達異常與人們心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤等的發(fā)生有關(guān)[8-9]。有學(xué)者在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型中檢測到了一些出現(xiàn)顯著變化的miRNA，并且證實了miRNA能夠影響淀粉樣前體蛋白的表達，并進一步導(dǎo)致Aβ的沉積[10]。Aβ又能影響miRNA的表達，Aβ是miRNA水平發(fā)生失衡的始動因子。兩者之間的這種關(guān)系會促進體內(nèi)的相互影響，從而影響阿爾茨海默病的進展[11]。

已有研究顯示miRNA-222可通過靶向抑制PPPLCA來提高tau蛋白的磷酸化水平[12]。據(jù)報道，miR-222與結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等有關(guān)[13]。有研究稱，血管性癡呆患者血清中的HDL-C含量低于健康人，HDL-C可能與血管性癡呆的發(fā)生有關(guān)[14]。與HDL-C不同，低認(rèn)知阿爾茨海默病患者血清中的LDL-C水平遠(yuǎn)高于健康者。

有研究者發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者血清miR-26b水平顯著降低，提示其與阿爾茨海默病的發(fā)生相關(guān)[15]。本研究也得出相同的結(jié)論，表明miR-26b可能對患者的神經(jīng)元損害有不利影響，影響其認(rèn)知功能。分析的原因是在阿爾茨海默病患者的腦組織中淀粉樣前β降解酶1（BACE1）的表達增加，導(dǎo)致相應(yīng)的病理變化。該研究認(rèn)為，miR-26b可以穿過靶基因BACE1的3’UTR區(qū)，并與BACE1表達的調(diào)控相結(jié)合，隨后在APP水解導(dǎo)致阿爾茨海默病后增加Aβ的產(chǎn)生和沉積，并可能通過調(diào)節(jié)BACE1來參與疾病進程，miR-26b可能還誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞周期停滯和更新，在Aβ和神經(jīng)元纖維纏結(jié)形成之前，就作用于細(xì)胞周期，影響細(xì)胞的生理過程，參與阿爾茨海默病的發(fā)生，具體機制還有待進一步的探討。

阿爾茨海默病患者血清中miR-26b和miRNA-222的低表達可能充當(dāng)阿爾茨海默病的潛在生物標(biāo)志物，并可能成為治療靶標(biāo)。兩者都與阿爾茨海默病的發(fā)病機制和發(fā)展及患者的認(rèn)知功能有關(guān)。但是，本研究的樣本量很小，未來的研究將擴大樣本量，以便進一步研究miR-26b和miRNA-222是否可以用作診斷早期阿爾茨海默病標(biāo)記和預(yù)測患者認(rèn)知功能的基礎(chǔ)指標(biāo)。

綜上所述，阿爾茨海默病患者的血清miR-26b、miR-222表達水平高于非阿爾茨海默病人群的平均水平，并且與患者認(rèn)知功能障礙程度有一定的關(guān)系。