密斑刺鲀(Diodon hystrix) gnrh基因的克隆及表達(dá)分析*

陳華譜 黃春仁 何睿祺 戴明姝 張明真 李智淵 黃 海 李廣麗①

密斑刺鲀()基因的克隆及表達(dá)分析*

陳華譜1黃春仁2何睿祺1戴明姝1張明真1李智淵1黃 海3李廣麗1①

(1. 廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心 廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實(shí)驗(yàn)室 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524088; 2. 海南晨海水產(chǎn)有限公司 三亞 572000; 3. 熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南熱帶海洋學(xué)院 三亞 572022)

密斑刺鲀()不僅具有食用價(jià)值, 同時(shí)也是傳統(tǒng)的中藥及保健食品, 但目前關(guān)于密斑刺鲀的生殖內(nèi)分泌調(diào)控研究較少, 限制了密斑刺鲀的人工繁育基礎(chǔ)理論的發(fā)展?？偹苤? 促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是生殖內(nèi)分泌調(diào)控的關(guān)鍵因子之一。利用轉(zhuǎn)錄組分析及分子克隆技術(shù), 獲得密斑刺鲀促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)和基因的cDNA開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)序列, 并利用生物信息學(xué)的方法, 獲得密斑刺鲀cDNA開放閱讀框共279 bp, 可編碼92個(gè)氨基酸殘基; 密斑刺鲀cDNA開放閱讀框共270 bp, 可編碼89個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 密斑刺鲀GnRH與鲀科類的魚具有較近的親緣關(guān)系。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)半定量的方法檢測(cè)和基因在密斑刺鲀各組織中的分布, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)和基因在脾、鰓和垂體中的表達(dá)量較高, 而在心臟中的表達(dá)量最低。此外, 利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)了密斑刺鲀和基因在性腺發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式, 結(jié)果顯示密斑刺鲀基因在不同的性腺發(fā)育時(shí)期中沒(méi)有顯著性的變化, 而基因隨著性腺發(fā)育成熟而不斷升高。研究主要獲得兩個(gè)創(chuàng)新性的重要結(jié)果: 首先是證實(shí)了密斑刺鲀存在兩種基因(和), 其次是提示了基因可能是密斑刺鲀生殖調(diào)控的主要類型。研究結(jié)果可為深入研究密斑刺鲀生殖內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)理提供研究方向和基礎(chǔ)。

密斑刺鲀(); GnRH; 分子克隆; 組織分布

密斑刺鲀()屬于鲀形目(Tetraodontiformes)、二齒鲀科(Diodontidae), 主要分布于熱帶海域, 如大西洋、太平洋、地中海、印度洋等地, 模式產(chǎn)地在印度, 主要棲息于沙石或礫石底質(zhì)海域(Bandyopadhyay, 2014)。該種魚身體表面含有長(zhǎng)刺, 正常情況下刺向后折疊, 受到攻擊時(shí)會(huì)使身體膨脹, 將刺豎起用以保護(hù)自己, 背部、側(cè)面和鰭有許多黑斑點(diǎn), 主要呈淺棕色(陳燕等, 2019)。盡管密斑刺鲀被認(rèn)為含有毒素(Trevett, 1997), 但因其肉質(zhì)鮮美, 魚皮富含膠原蛋白, 屬于傳統(tǒng)的海洋藥用生物, 深受太平洋島嶼國(guó)以及中國(guó)海南南部地區(qū)的歡迎(Bandyopadhyay, 2014; 馬軍等, 2020)。當(dāng)前, 由于過(guò)度捕撈, 密斑刺鲀野生資源受到了破壞, 由此急需開展密斑刺鲀的人工繁育及資源增殖。

在自然資源下降的情況下, 開發(fā)新的海洋魚類資源是人類獲取優(yōu)質(zhì)食物蛋白的重要途徑, 開發(fā)新的海洋魚種并成功實(shí)現(xiàn)其人工養(yǎng)殖, 首要前提是認(rèn)識(shí)該魚種的生殖特性, 以控制其生殖周期和產(chǎn)卵(柳學(xué)周等, 2013)。魚類的生殖受到腦-垂體-性腺軸的調(diào)控, 最先由下丘腦分泌合成促性腺激素釋放激素(GnRH), GnRH屬于一種多肽類激素, 是性腺發(fā)育與性激素合成的關(guān)鍵內(nèi)分泌調(diào)控因子, 同時(shí)也是“下丘腦-垂體-性腺”軸的原始動(dòng)力(Zohar, 2010)。它是以脈沖的方式進(jìn)行分泌, 之后進(jìn)入垂體門脈系統(tǒng), 到達(dá)垂體前葉和GnRHR特異性結(jié)合激活信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制, 刺激垂體黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的合成及釋放, 最后通過(guò)血液循環(huán)調(diào)節(jié)性腺的活動(dòng)(張樹芳, 2018; Mu?oz-Cueto, 2020)。

目前, 研究人員們?cè)诩棺祫?dòng)物中共鑒定出15種不同分子形式的基因, 在硬骨魚類中發(fā)現(xiàn)了8種不同分子形式的GnRH。不同分子形式的GnRH都具有共同的核心十肽結(jié)構(gòu), 并在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中顯示出保守的結(jié)構(gòu)特征, 從而組成了GnRH多肽家族(Somoza, 2002)。在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中, GnRH有兩種形式, 即GnRH1 (Mammalian-GnRH)和GnRH2 (Chicken GnRH), 部分硬骨魚除了GnRH1和GnRH2, 還有GnRH3 (Salmon GnRH) (Okubo, 2008; 李婉茹等, 2020)。GnRH2主要功能是調(diào)控動(dòng)物的食欲和性行為, 集中于中腦部位, 聚集在中腦前端和間腦后端的交匯處, 緊挨動(dòng)眼神經(jīng)(Tostivint, 2011), 但是關(guān)于GnRH2的確切功能現(xiàn)今依然存在很大的爭(zhēng)議, 一般認(rèn)為是發(fā)揮了神經(jīng)遞質(zhì)的作用(Kanda, 2010)。GnRH3主要分布于前腦并能延伸到神經(jīng)末端, 精確定位是在嗅神經(jīng)和端腦的融合處, 可能間接參與刺激垂體激素釋放的生理過(guò)程, 雖然GnRH3不能直接刺激垂體, 但是在嗅覺泡和前視覺形成處等區(qū)域有和GnRH1共表達(dá)的區(qū)域, GnRH1的作用是刺激促性腺激素的釋放(Wirsig-Wiechmann, 2001)。目前關(guān)于GnRH的生理功能在多種魚類中開展了研究(Chen, 2020), 但在鲀形目魚類中的研究相對(duì)較少(Mu?oz-Cueto, 2020), 有待于進(jìn)一步研究。

密斑刺鲀雖含有毒素, 但因肉質(zhì)鮮美而被很多人喜愛, 但目前對(duì)于密斑刺鲀的研究較少, 人工繁育也未見報(bào)道, 阻礙了密斑刺鲀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展(陳燕等, 2019; 馬軍等, 2020), 因此, 研究其生長(zhǎng)生殖調(diào)控并作為人工育種工作的指導(dǎo)是必要的。本研究克隆了密斑刺鲀和基因, 并分析了其表達(dá)模式, 探究了基因的特性, 分析序列結(jié)構(gòu)特征, 本研究結(jié)果為深入探索密斑刺鲀的基因在生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)理提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

密斑刺鲀()實(shí)驗(yàn)魚為三亞近海捕撈, 活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后經(jīng)冰上深度麻醉后取適量腦、垂體、性腺、肌肉、肝臟、心臟、脾、腎臟和鰓組織, 經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)入–80°C冰箱保存, 用于總RNA提取及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

總RNA提取Trizol試劑盒; PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒; DNAMarker2000; rTaq酶; 克隆用載體pMD19-T Vector; 無(wú)菌水; DEPC水(0.1%); 1×TAE電泳緩沖液; LB液體培養(yǎng)基; 氨芐青霉素(AMP)溶液; 含AMP抗性的LB固體培養(yǎng)基。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

總RNA的提取采用Trizol試劑盒進(jìn)行, 對(duì)密斑刺鲀的肌肉、精巢、垂體、腎臟、腦、肝臟、心臟、脾和鰓組織進(jìn)行提取。RNA檢測(cè)采用1% (質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳, 使用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和質(zhì)量。所有RNA樣品各取1 μg, 按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA。

1.4 gnrh2和gnrh3基因的cDNA克隆

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)利用高通量測(cè)序的方法, 構(gòu)建密斑刺鲀?nèi)X的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù), 并通過(guò)同源比對(duì), 同時(shí)也結(jié)合密斑刺鲀基因組數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)的比對(duì), 獲得密斑刺鲀和基因的片段scaffold, 根據(jù)scaffold序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行開放閱讀框ORF克隆(表l), 獲得和基因cDNA序列。

1.4.2 分子克隆 取等量的密斑刺鲀?nèi)X的cDNA作為模板進(jìn)行PCR克隆。PCR體系為10 μL: 5 μL rTaq酶, 0.4 μL上游引物, 0.4 μL下游引物, 0.4 μL混合cDNA模板, 3.8 μL雙蒸水。PCR程序: 預(yù)變性95°C、5 min; 變性95°C、30 s, 退火59°C、30 s, 延伸72°C、30 s, 共32個(gè)循環(huán); 延伸72°C、10 min; 4°C保存。將PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳, 切取目的片段回收, 連接到pMD19-T Vector載體, 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性菌落, 送生物公司測(cè)序。

表1 密斑刺鲀和基因克隆以及組織分布的引物

Tab.1 Primers for cloning and distribution of gnrh2 and gnrh3

1.5 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用DNAstar軟件預(yù)測(cè)密斑刺鲀和基因的開放閱讀框序列, 翻譯成氨基酸序列, 然后與其他脊椎動(dòng)物GnRH蛋白前體序列進(jìn)行同源比對(duì)。運(yùn)用在線軟件SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽。運(yùn)用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析GnRH2和GnRH3的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用SoftBerry在線預(yù)測(cè)工具(http://linux1.softberry.com/berry.phtml? Topic = psite&group= programs & subgroup = proloc)預(yù)測(cè)GnRH2和GnRH3氨基酸序列的功能位點(diǎn)。運(yùn)用Mega 7.0軟件對(duì)密斑刺鲀的基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。通過(guò)軟件Swiss-model進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)與結(jié)構(gòu)分析。

1.6 組織分布

以密斑刺鲀肌肉、精巢、垂體、腎臟、腦、肝臟、心臟、脾和鰓的cDNA作為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 完成和基因組織分布的半定量分析, 內(nèi)參為基因。PCR體系為10 μL: 5 μL Taq酶, 0.4 μL上游引物, 0.4 μL下游引物, 0.4 μL cDNA模板, 3.8 μL雙蒸水。目標(biāo)基因PCR程序: 預(yù)變性95 °C、5 min; 變性95 °C、30 s, 退火59°C、30 s, 延伸72 °C、30 s, 共40個(gè)循環(huán); 延伸72°C、10 min; 4 °C保存。PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 然后對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照, 完成半定量分析。

1.7 性腺組織學(xué)

將實(shí)驗(yàn)魚經(jīng)麻醉劑深度麻醉后, 快速取出卵巢, 參考經(jīng)典石蠟切片的方法進(jìn)行組織學(xué)分析(Chen, 2020)。根據(jù)性腺的發(fā)育時(shí)期進(jìn)行樣本的分析與歸類。

1.8 實(shí)時(shí)熒光的定量

參照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japan)試劑盒說(shuō)明書準(zhǔn)備反應(yīng)體系, 利用RocheLight Cycler 480 real time PCR system檢測(cè)和在下丘腦中的表達(dá)。具體反應(yīng)程序?yàn)? 首先95 °C預(yù)變性1 min; 95 °C變性5 s, 58 °C退火10 s, 72 °C延伸20 s, 84 °C收集熒光10 s, 共40個(gè)循環(huán); 溶解曲線: 95 °C 1 min, 52 °C 1 min, 95 °C延伸。每個(gè)樣品3次重復(fù), 目標(biāo)基因的相對(duì)定量利用=2–??Ct的方法進(jìn)行計(jì)算, 并通過(guò)SPSS16.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 密斑刺鲀gnrh cDNA克隆及序列分析

2.1.1cDNA克隆及序列分析 本研究從密斑刺鲀中克隆得到基因的cDNA序列, 密斑刺鲀cDNA開放閱讀框(ORF)共279 bp, 可編碼92個(gè)氨基酸, 分子量為10.30 kDa。密斑刺鲀GnRH2前體蛋白由4部分組成: 信號(hào)肽(30個(gè)氨基酸)、GnRH2核心十肽(QHWSHGWYPG)、酶切位點(diǎn)(GKR)以及GnRH相關(guān)肽(49個(gè)氨基酸) (圖1)。并預(yù)測(cè)GnRH2前體蛋白具有SCOP domain d1rype功能位點(diǎn)。

2.1.2基因的cDNA克隆及序列分析 本研究從密斑刺鲀中克隆得到基因的cDNA序列, 密斑刺鲀由325個(gè)核苷酸組成, cDNA開放閱讀框(ORF)共270 bp, 可編碼89個(gè)氨基酸, 分子量為9.94 kDa。密斑刺鲀GnRH3前體蛋白由4部分組成: 信號(hào)肽(23個(gè)氨基酸)、GnRH3核心十肽(QHWSYGWLPG)、酶切位點(diǎn)(GKR)以及GnRH相關(guān)肽(56個(gè)氨基酸)(圖2)。并預(yù)測(cè)GnRH3前體蛋白具有SCOP domain d1oaca4以及d1kcgc兩個(gè)功能位點(diǎn)。

圖1 密斑刺鲀gnrh2基因開放閱讀框序列及其推測(cè)的氨基酸序列

2.2 密斑刺鲀GnRH氨基酸序列比對(duì)及同源性分析

2.2.1 GnRH2的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析 本實(shí)驗(yàn)采用Clustal X法對(duì)密斑刺鲀與其他物種GnRH2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。與密斑刺鲀GnRH2氨基酸序列作比較的物種有銀大麻哈魚()、大西洋鮭()、白鮭()、紅點(diǎn)鮭()、虹鱒()、竹筴魚()、鉛點(diǎn)東方鲀()等13種動(dòng)物。同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀GnRH2核心肽區(qū)域(QHWSHGWYPG)與其他物種具有極好的同源性(圖3)。

2.2.2 GnRH3的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析 本實(shí)驗(yàn)采用Clustal X法對(duì)密斑刺鲀與其他物種GnRH3氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。與密斑刺鲀GnRH3氨基酸序列作比較的物種有莫桑比克羅非魚()、革首南極魚()、大彈涂魚()、三刺魚()、斑紋隱小鳉()、軍曹魚()等16種生物。同樣, 同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀GnRH3核心肽區(qū)域(QHWSYGWLPG)與其他物種具有極好的同源性(圖4)。

2.3 密斑刺鲀GnRH氨基酸序列其他功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.3.1 GnRH2氨基酸序列其他功能位點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用SoftBerry在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)GnRH2氨基酸序列的其他功能位點(diǎn), 包括: 酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、?；稽c(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列、促性腺激素釋放激素特征(表2)。

2.3.2 GnRH3氨基酸序列其他功能位點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用SoftBerry在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)GnRH3氨基酸序列的其他功能位點(diǎn), 包括: N-糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、?；稽c(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、微體C-末端靶向信號(hào)、促性腺激素釋放激素特征(表3)。

圖2 密斑刺鲀gnrh3基因開放閱讀框序列及其推測(cè)的氨基酸序列

2.4 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用Mega7.0軟件的鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建GnRH蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹, 以確定密斑刺鲀GnRH2和GnRH3的進(jìn)化關(guān)系。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示, 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3分別與其他物種的GnRH2和GnRH3聚類在一起, 其中密斑刺鲀GnRH2與竹筴魚()、綠河鲀()、紅鰭東方鲀()和鉛點(diǎn)東方鲀()在一個(gè)分支上, 而密斑刺鲀GnRH3與蝦虎魚()和大彈涂魚()在一個(gè)分支上, 結(jié)果表明: 與其他物種相比, 密斑刺鲀GnRH2與竹筴魚、綠河鲀、紅鰭東方鲀和鉛點(diǎn)東方鲀有較近的親緣關(guān)系, 而密斑刺鲀GnRH3與蝦虎魚和大彈涂魚有較近的親緣關(guān)系(圖5)。

2.5 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因的組織表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法, 對(duì)密斑刺鲀和基因在腦、垂體、精巢、肌肉、肝臟、心臟、脾、腎臟和鰓組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析。電泳結(jié)果顯示, 密斑刺鲀和基因在各組織中都有分布, 在脾、鰓和垂體中表達(dá)量較高, 在腦和精巢中表達(dá)量中等, 而在心臟表達(dá)量最低(圖6)。

2.6 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

構(gòu)建GnRH2和GnRH3的蛋白質(zhì)核心十肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)。結(jié)果表明密斑刺鲀GnRH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和人類的GnRH核心肽結(jié)構(gòu)相同, 均呈現(xiàn)α螺旋, 其中密斑刺鲀的GnRH2與人類的mGnRH的結(jié)構(gòu)更加相似。

2.7 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在性腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式

根據(jù)密斑刺鲀的卵巢和精巢發(fā)育的特征進(jìn)行發(fā)育時(shí)期的分期與歸類, 分別獲得密斑刺鲀卵巢和精巢的早、中和晚期3個(gè)發(fā)育階段的下丘腦樣本(圖8), 每個(gè)時(shí)期5個(gè)樣本(=5)。然后利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)密斑刺鲀下丘腦中的和基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式, 結(jié)果顯示密斑刺鲀基因在卵巢和精巢不同的發(fā)育時(shí)期中沒(méi)有顯著性變化, 而基因隨著性腺的發(fā)育成熟而不斷升高(圖9)。

圖3 密斑刺鲀與其他物種GnRH2氨基酸序列的多重比對(duì)

注: 以上各物種在NCBI登錄號(hào):(銀大麻哈魚) XP_020349613.1,(大西洋鮭) XP_013987737.1,(白鮭) AAP57219.1,(紅點(diǎn)鮭) XP_023847647.1,(虹鱒) NP_001117717.1,(竹筴魚) AGP75910.1,(綠河鲀) BAE45690.1,(紅鰭東方鲀) XP_003973604.1,(鉛點(diǎn)東方鲀) BAJ07189.1,(斑馬魚) NP_852104.3,(草魚) ACH78253.1,(青海湖裸鯉) ATO59775.1,(人) AAI15401.1

3 討論

魚類的生殖系統(tǒng)從不成熟轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓恼麄€(gè)過(guò)程就是其性腺發(fā)育的過(guò)程, 整個(gè)生殖過(guò)程共分兩個(gè)階段, 首先是神經(jīng)聯(lián)系起主要作用, 是指感覺器官捕獲外界刺激, 并將其傳送到腦, 再通過(guò)神經(jīng)聯(lián)系傳遞到下丘腦; 接下來(lái)是下丘腦、垂體、性腺三個(gè)水平上的激素起主要作用, 下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(GnRH), 激發(fā)垂體分泌促性腺激素, 促性腺激素作用于性腺并促使其分泌性類固醇激素, 以促使性腺發(fā)育成熟并排出精子和卵子(王蘊(yùn), 2006)。

圖4 密斑刺鲀與其他物種GnRH3氨基酸序列的多重比對(duì)

注: 以上各物種在NCBI登錄號(hào):(莫桑比克羅非魚) AAO11648.1,(革首南極魚) XP_010782456.1,(大彈涂魚) XP_020776969.1,(三刺魚) AFY12650.1,(黑海鱸) AHB89706.1,(蝦虎魚) BBD05664.1,(斑紋隱小鳉) XP_017287543.1,(藍(lán)線鰭魚) ABW86800.1,(許氏平鲉) AFS52223.1,(玉麗體魚) ADV31311.2,(斑馬魚) NP_878307.2,(伯氏樸麗魚) NP_001273267.1,(尖吻鱸) AGE13360.1,(軍曹魚) AAT80332.1,(點(diǎn)帶石斑魚) ACZ51151.1,(鯔魚) AAQ83268.1

表2 GnRH2的其他功能位點(diǎn)

Tab.2 Other functional sites in GnRH2

表3 GnRH3的其他功能位點(diǎn)

Tab.3 Other functional sites in GnRH3

本研究對(duì)密斑刺鲀的和基因進(jìn)行克隆和分析, 并通過(guò)密斑刺鲀轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)和基因組數(shù)據(jù)比對(duì), 發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀只存在兩種GnRH類型, 與其他鲀型目魚類一樣(Mu?oz-Cueto, 2020)。利用軟件預(yù)測(cè)密斑刺鲀和基因的開放閱讀框序列, 翻譯成氨基酸序列, 然后進(jìn)行生物學(xué)信息分析。密斑刺鲀cDNA開放閱讀框(ORF)共279 bp, 可編碼92個(gè)氨基酸, GnRH2核心十肽(QHWSHGWYPG)位于31—40 aa位置, 具有SCOP domain d1rype功能位點(diǎn); 密斑刺鲀cDNA開放閱讀框(ORF)共270 bp, 可編碼89個(gè)氨基酸, GnRH3核心十肽(QHWSYGWLPG)位于24—33 aa位置, 具有SCOP domain d1oaca4以及d1kcgc_兩個(gè)功能位點(diǎn)。通過(guò)在線預(yù)測(cè)氨基酸序列功能位點(diǎn), 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3的核心十肽均被定義為促性腺激素釋放激素特征。與其他脊椎動(dòng)物GnRH蛋白前體序列進(jìn)行同源比對(duì), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀GnRH2和GnRH3核心肽區(qū)域有極好的同源性, 這與其他物種的GnRH研究結(jié)果一致(吳旭等, 2005; 丁煒東等, 2006; 王濱等, 2017; Wang, 2019)。

表達(dá)量的組織分布結(jié)果顯示, 密斑刺鲀和基因在各組織中都有分布, 在脾、鰓和垂體中表達(dá)量較高, 在腦和精巢中表達(dá)量中等, 而在心臟表達(dá)量最低。在經(jīng)典理論中,主要在腦中表達(dá)(周曉蘇, 2012), 在多種魚類中也發(fā)現(xiàn)主要表達(dá)于腦部, 如: 圓斑星鰈() (柳學(xué)周等, 2013)、許氏平鲉() (周曉蘇, 2012)、半滑舌鰨() (周曉蘇, 2012)和金錢魚() (Chen, 2020)。但有研究發(fā)現(xiàn), 在多組織中有基因表達(dá)(Kovacs, 2001), 魚類中鰈形目的牙鲆()在腦、胃、脾臟、眼、垂體、肌肉、腸、卵巢和腎臟中均有較高表達(dá)分布(房保海, 2006)。在不同組織中,具不同的生物學(xué)功能(Huang, 2001)。本研究發(fā)現(xiàn)密斑刺鲀和除了在腦和精巢外, 還在多組織中有表達(dá), 說(shuō)明密斑刺鲀和與生殖調(diào)控有關(guān)的同時(shí)還存在其他生物功能。

密斑刺鲀下丘腦的和基因在卵巢和精巢發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)顯示出不同的表達(dá)模式和特征。密斑刺鲀?cè)诼殉埠途舶l(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)沒(méi)有顯著性的變化, 從中暗示了可能不是調(diào)控密斑刺鲀性腺發(fā)育的主要類型。研究表明, 在虹鱒的性腺發(fā)育和成熟過(guò)程中, 檢測(cè)到下丘腦有低濃度的mRNA表達(dá), 但是整個(gè)發(fā)育過(guò)程的表達(dá)量變化不明顯(Madigou, 2000), 結(jié)果與本文的研究結(jié)果相吻合。密斑刺鲀基因隨著卵巢和精巢的發(fā)育成熟而不斷顯著升高, 與縱痕平鲉() (Collins, 2001)、真鯛() (Senthilkumaran, 1999)、大菱鲆() (Andersson, 2001)和金錢魚(Chen, 2020)等魚類的表達(dá)模式相類似, 從中表明GnRH3可能是密斑刺鲀生殖調(diào)節(jié)的主要GnRH亞型。

圖5 GnRH系統(tǒng)進(jìn)化樹

注: 以上各物種在NCBI登錄號(hào): GnRH1:(美國(guó)紅魚) AAT80331.1,(大黃魚) NP_001290285.1,(波紋絨須石首魚) AAQ16501.2,(軍曹魚) AAT80334.1,(巖石斑魚) AEI54997.1,(金眼狼鱸) AAY17516.1,(云紋犬牙石首魚) AAV74401.1; GnRH2:(銀大麻哈魚) XP_020349613.1,(大西洋鮭) XP_013987737.1,(白鮭) AAP57219.1,(紅點(diǎn)鮭) XP_023847647.1,(虹鱒) NP_001117717.1,(竹筴魚) AGP75910.1,(綠河鲀) BAE45690.1,(紅鰭東方鲀) XP_003973604.1,(鉛點(diǎn)東方鲀) BAJ07189.1,(斑馬魚) NP_852104.3,(草魚) ACH78253.1,(青海湖裸鯉) ATO59775.1,(人) AAI15401.1,(小鼠) AAI16898.1; GnRH3:(莫桑比克羅非魚) AAO11648.1,(革首南極魚) XP_010782456.1,(大彈涂魚) XP_020776969.1,(三刺魚) AFY12650.1,(黑海鱸) AHB89706.1,(蝦虎魚) BBD05664.1,(斑紋隱小鳉) XP_017287543.1,(藍(lán)線鰭魚) ABW86800.1,(許氏平鲉) AFS52223.1,(玉麗體魚) ADV31311.2,(斑馬魚) NP_878307.2,(伯氏樸麗魚) NP_001273267.1,(尖吻鱸) AGE13360.1,(軍曹魚) AAT80332.1,(點(diǎn)帶石斑魚) ACZ51151.1,(鯔魚) AAQ83268.1; 黑三角表示研究的物種密斑刺鲀

圖6 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在不同組織中的表達(dá)

注: G. 鰓, P. 垂體, T. 精巢, H. 心臟, S. 脾, K. 腎臟, B. 腦, L. 肝臟, M. 肌肉, NC. 空白對(duì)照

圖7 人和密斑刺鲀GnRH蛋白質(zhì)核心肽的三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)

注: a. 人mGnRH蛋白質(zhì)核心肽的三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu); b. 密斑刺鲀GnRH 2核心肽的三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu); c: 密斑刺鲀GnRH 3核心肽的三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)

4 結(jié)論

綜上所述, 本研究克隆獲得了密斑刺鲀和基因的ORF序列, 并通過(guò)生物信息學(xué)分析, 密斑刺鲀GnRH2核心十肽(QHWSHGWYPG)和GnRH3核心十肽(QHWSYGWLPG)具有促性腺激素釋放激素特征, 且在進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出高度的保守性。和除了在密斑刺鲀腦和精巢有表達(dá)外, 還在多組織中有表達(dá), 說(shuō)明了和在密斑刺鲀中與生殖調(diào)控有關(guān)的同時(shí)還存在其他生物功能。此外, 進(jìn)一步研究了密斑刺鲀和基因在卵巢和精巢發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)模式, 表明了GnRH3可能是密斑刺鲀生殖調(diào)節(jié)的主要GnRH亞型。本研究通過(guò)對(duì)密斑刺鲀和基因的探索, 為密斑刺鲀的人工繁殖提供理論基礎(chǔ)。

圖8 密斑刺鲀的性腺發(fā)育組織切片圖

注: a. 卵巢發(fā)育早期, b. 卵巢發(fā)育中期, c. 卵巢發(fā)育成熟期, d. 精巢發(fā)育早期, e. 精巢發(fā)育中期, f. 精巢發(fā)育成熟期。O1. 初級(jí)卵母細(xì)胞(primary-growth stage oocyte); O2. 皮層小泡卵母細(xì)胞(cortical-alveolus stage oocyte); O3. 卵黃形成卵母細(xì)胞(vitellogenic stage oocyte); SG. 精原細(xì)胞(spermatogonia); SCⅠ. 初級(jí)精母細(xì)胞(spermatocyteⅠ); SCⅡ. 次級(jí)精母細(xì)胞(spermatocyteⅡ); ST. 精子細(xì)胞(spermatid); SZ. 精子(spermatozoa)。標(biāo)尺為200 μm

圖9 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在性腺發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)

注: a和b分別表示和基因在卵巢發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式; c和d分別表示和基因在精巢發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。相對(duì)表達(dá)量用平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)方差表示; 上標(biāo)不同字母表示組間的顯著性差異(<0.05,=5)

丁煒東, 曹麗萍, 李建林等, 2006. 奧利亞羅非魚促性腺激素釋放激素及相關(guān)肽基因的克隆與表達(dá). 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 21(3): 207—211

馬 軍, 劉嘉鑫, 江智景等, 2020. 基于RNA-seq數(shù)據(jù)的密斑刺鲀SSR分子標(biāo)記開發(fā)及鑒定. 南方水產(chǎn)科學(xué), 16(1): 127—136

王 濱, 柳學(xué)周, 劉 權(quán)等, 2017. 半滑舌鰨()2基因克隆、組織分布及卵巢成熟過(guò)程中表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 38(1): 63—72

王 蘊(yùn), 2006. 鯉魚()促性腺激素的純化及其α亞基新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn). 武漢: 中國(guó)科學(xué)院研究生院(水生生物研究所)碩士學(xué)位論文

李婉茹, 張玲玲, 張美溦等, 2020. 海灣扇貝促性腺激素釋放激素基因克隆及表達(dá)分析. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 50(2): 68—74

楊憲寬, 趙會(huì)宏, 林權(quán)卓等, 2015. 雙棘黃姑魚促性腺激素釋放激素基因的克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析. 水產(chǎn)科學(xué), 34(4): 245—250

吳 旭, 陳寬維, 王金玉等, 2005. 促性腺激素釋放激素及其基因表達(dá)調(diào)控. 黃牛雜志, 31(3): 49—52

張樹芳, 2018. 中華絨螯蟹促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)同系物的克隆及其表達(dá)特征. 上海: 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文

陳 燕, 馬 軍, 鄭 軍等, 2019. 密斑刺鲀膠原蛋白的提取和成分分析. 海南熱帶海洋學(xué)院學(xué)報(bào), 26(5): 12—17

周曉蘇, 2012. 許氏平鲉和半滑舌鰨促性腺激素釋放激素(GnRH)基因的克隆和表達(dá)分析. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文

房保海, 2006. 牙鲆促性腺激素釋放激素及其免疫影響的研究. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文

柳學(xué)周, 徐永江, 廖梅杰等, 2013. 圓斑星鰈促性腺激素釋放激素基因克隆及表達(dá)特性. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 20(1): 12—24

Andersson E, Fjelldal P G, Klenke U, 2001. Three forms of GnRH in the brain and pituitary of the turbot,: immunological characterization and seasonal variation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 129(2/3): 551—558

Bandyopadhyay S A, 2014. On the record of a spot-fin porcupine fish,(Linnaeus, 1758) from Mandarmani, Bay of Bengal Coast of West Bengal, India. Proceedings of the Zoological Society, 67(2): 175—177

Chen H P, Cui X F, Wang Y R, 2020. Identification, functional characterization, and estrogen regulation on gonadotropin-releasing hormone in the spotted scat,. Fish Physiology and Biochemistry, 46(5): 1743—1757

Collins P M, O’Neill D F, Barron B R, 2001. Gonadotropin-releasing hormone content in the brain and pituitary of male and female grass rockfish () in relation to seasonal changes in reproductive status. Biology of Reproduction, 65(1): 173—179

Huang W Q, Yao B, Sun L, 2001. Immunohistochemical andhybridization studies of gonadotropin releasing hormone (GnRH) and its receptor in rat digestive tract. Life Sciences, 68(15): 1727—1734

Kanda S, Nishikawa K, Karigo T, 2010. Regular pacemaker activity characterizes gonadotropin-releasing hormone 2 neurons recorded from green fluorescent protein-transgenic medaka. Endocrinology, 151(2): 695—701

Kovacs M, Schally A V, 2001. Comparison of mechanisms of action of luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) antagonist cetrorelix and LHRH agonist triptorelin on the gene expression of pituitary LHRH receptors in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(21): 12197—12202

Madigou T, Ma?anos-Sanchez E, Hulshof S, 2000. Cloning, tissue distribution, and central expression of the gonadotropin-releasing hormone receptor in the rainbow trout (). Biology of Reproduction, 63(6): 1857—1866

Mu?oz-Cueto J A, Zmora N, Paullada-Salmerón J A, 2020. The gonadotropin-releasing hormones: lessons from fish. General and Comparative Endocrinology, 291: 113422

Okubo K, Nagahama Y, 2008. Structural and functional evolution of gonadotropin-releasing hormone in vertebrates. Acta Physiologica, 193(1): 3—15

Senthilkumaran B, Okuzawa K, Gen K, 1999. Distribution and seasonal variations in levels of three native GnRHs in the brain and pituitary of perciform fish. Journal of Neuroendocrinology, 11(3): 181—186

Somoza G M, Lescheid D W, Miranda L A, 2002. Expression of pejerrey gonadotropin-releasing hormone in three orders of fish. Biology of Reproduction, 67(6): 1864—1871

Tostivint H, 2011. Evolution of the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) gene family in relation to vertebrate tetraploidizations. General and Comparative Endocrinology, 170(3): 575—581

Trevett A J, Mavo B, Warrell D A, 1997. Tetrodotoxic poisoning from ingestion of a porcupine fish () in Papua New Guinea: nerve conduction studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 56(1): 30—32

Wang W Q, Chen J, Fang Y, 2019. Identification ofandand their expression during brood pouch growth and short-term benzo(a)pyrene exposure in lined seahorse (). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 225: 108579

Wirsig-Wiechmann C R, 2001. Function of gonadotropin-releasing hormone in olfaction. The Keio Journal of Medicine, 50(2): 81—85

Zohar Y, Mu?oz-Cueto J A, Elizur A, 2010. Neuroendocrinology of reproduction in teleost fish. General and Comparative Endocrinology, 165(3): 438—455

CLONING AND EXPRESSION OFGENE IN

CHEN Hua-Pu1, HUANG Chun-Ren2, HE Rui-Qi1, DAI Ming-Shu1, ZHANG Ming-Zhen1, LI Zhi-Yuan1, HUANG Hai3, LI Guang-Li1

(1. Guangdong Research Center on Reproductive Control and Breeding Technology of Indigenous Valuable Fish Species, Guangdong Provincial Engineering Laboratory for Mariculture Organism Breeding, Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Hainan Chenhai Aquatic Products Co., Ltd, Sanya 572000, China; 3. Key Laboratory of Utilization and Conservation for Tropical Marine Bioresources, Ministry of Education, Hainan Key Laboratory for Conservation and Utilization of Tropical Marine Fishery Resources, Hainan Tropical Ocean University, Sanya 572022, China)

is an edible fish with commercial value and additional value for traditional Chinese medicine and health care. However, studies on its endocrinology and artificial breeding are few, which hinders the practice of artificial breeding. It is known that gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is a key regulation factor of reproduction. In the present study, two subtypes ofgenes, named asand, were cloned form the brain ofby transcriptome analysis and molecular cloning. Results show that the open reading frame (ORF) ofgene cDNA was 279 bp, encoding 92 amino acids, and the ORF ofgene cDNA was 270 bp, encoding 89 amino acids. The phylogenetic analysis showed thatGnRHs are closely related to the GnRHs of pufferfish family.andgenes were expressed under different levels in all the detected tissues with semi-quantitative polymerase chain reaction (PCR) method, showing the lowest expressions in heart and the rather high expressions in spleen, gill, and pituitary. Furthermore, real-time quantitative PCR was used to detected the expression profiles ofandgenes during the ovarian and testicular developments, showing no significant change in the expressions ofin both of ovarian and testicular developments, while the expression ofshowed gradual significant increase with the maturation processes of ovarian and testicular. Two important facts were revealed in this study. First, twogenes (and) were confirmed in; and secondly, thegene was the maintype of reproductive regulation in. The present study provides a reference for future study on the mechanism of the reproductive endocrine regulation in.

; GnRH; molecular cloning; tissue distribution

* 海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, ZDYF2018225號(hào); 熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2020年開放課題, UCTMB20201號(hào); 海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目, ZDKJ2016009號(hào); 海南熱帶海洋學(xué)院2016年學(xué)科帶頭人和博士研究生科研啟動(dòng)項(xiàng)目, RHDXB201612號(hào)。陳華譜, 博士, E-mail: chpjwx@163.com

李廣麗, 教授, E-mail: ligl@gdou.edu.cn

2021-01-25,

2021-02-28

S965.3

10.11693/hyhz20210100022