AMI患者血漿miR-221-3p、miR-208b-3p表達水平與心肌損傷標志物及左心功能的關系

宮柏琪 張琳 王娜 李強 曹甜甜

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常見的心血管系統(tǒng)疾病，全球每年發(fā)病例數(shù)達700萬，患者一年病死率約10%，是導致患者死亡的主要原因[1]。冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂、血栓形成及血管痙攣等因素引起部分或完全冠狀動脈阻塞是AMI的病理基礎。肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)及肌鈣蛋白(cTnI)等是臨床上常用的診斷AMI標志物，但這些標志物在臨床癥狀發(fā)生后的幾個小時內(nèi)水平不會明顯變化，并且在心肌炎、心功能不全的患者中上述指標也會升高，影響AMI的早期診斷[2]。因此，有必要尋找新的AMI生物標志物。微小MicroRNA(miRNA，miR)是內(nèi)源的長度為19～25 nt 非編碼單鏈RNA，通過影響mRNA降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控基因表達。miR在生理和病理過程中起著至關重要的作用，參與細胞發(fā)育、分化、增殖、遷移和應激反應[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR是新的心血管疾病的生物標志物，在AMI，充血心力衰竭，冠心病等多種疾病中異常表達[4]。心肌細胞中富含多種miRNA，如miR-1、miR-208b，miR-221-3p等，近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者血漿miR-208b，miR-221-3p均存在異常表達的現(xiàn)象，有助于反映AMI疾病發(fā)展的進程，因此，血漿miR-208b，miR-221-3p可能是潛在的診斷AMI的生物標志物[5,6]。本研究通過檢測血漿miR-221-3p、miR-208b-3p水平，研究二者與其他心肌損傷標志物及左心室功能關系，探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月到2019年1月接受治療的AMI患者132例作為AMI組，其中男81例，女51例；年齡38～69歲，平均年齡(52.61±7.50)歲；ST段抬高型心肌梗死(STEMI)92例，非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)40例；采用全球急性冠狀動脈事件注冊(GRACE)風險評分系統(tǒng)對AMI組患者進行危險分層評分[8]，具體評分指標包括，KiIIip分級、收縮壓、心率、年齡、血肌酐、心電圖ST段下移、心肌酶升高及院前心臟停跳，GRACE評分>140為高危組，共49例，109≤GRACE評分<140為中危組，共47例，GRACE評分≤108為低危組，共36例。另選取同期在我院健康體檢的人群48例作為對照組，其中男29例，女19例；年齡36～72歲，平均年齡(51.13±7.24)歲。既往均無胸痛胸悶等表現(xiàn)、心電圖、胸片、血生化、心肌酶學等檢查未見異常。本次研究經(jīng)我院倫理委員會的批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①AMI診斷標準參考歐洲心臟病學會(ESC)/美國心臟病學會(ACC)聯(lián)合制定的2018年第四版全球心肌梗死指南[7]，并結(jié)合患者心肌缺血癥狀、心電圖、心肌酶譜及影像學檢查等；②患者為初次發(fā)作；③患者對本次研究均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①同時合并有惡性腫瘤、感染性疾病及自身免疫性疾??；②既往患有心肌炎、心肌梗死等心臟病病史；③合并有精神疾病，不能配合本研究。

1.3 血漿miR-221-3p、miR-208b-3p的檢測 抽取2組清晨空腹靜脈血約8 ml，2 500 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，去除血細胞后分裝于1號管、2號管，取1號管采用實時熒光定量PCR法(qPCR)檢測血漿miR-221-3p、miR-208b-3p的表達，采用 Trizol 法提取血漿中的總RNA，溶于DEPC水中后使用Narodrop測定RNA濃度及純度，A260/A280=1.8～2.1為宜，將總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，以cDNA為模板，對miR-221-3p、miR-208b-3p進行qPCR檢測。引物序列均由上海生工公司合成，以U6為內(nèi)參，上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物序列:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，miR-221-3p上游引物:5’-CGGCTACATTGTCTGCCTG-3’，下游引物:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，miR-208b-3p上游引物:5’-CCGATAAGACGAACAA-3’，下游引物:5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’。實驗步驟按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說明書進行(購自德國Qiagen公司,Cat.No.218076)。反應條件：95℃ 10 min變性后，95℃ 10 s，75℃ 30 s，60℃ 10 s，40個循環(huán)?？偡磻w系10 μl，cDNA 4 μl、上下游引物各0.5 μl、SYBR-Green PCR Master mix 5 μl。采用2-ΔΔCt法計算血漿中miR-221-3p、miR-208b-3p的相對表達量。

1.4 心肌損傷標志物及左心功能指標的檢測 取2號管進行檢測，心肌損傷指標采用放射免疫沉淀法測定，檢測指標包括：肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、CK-MB及內(nèi)皮素1(endothelin 1，ET-1)，采用全自動生化分析儀(roche，cobasE601)檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、三酰甘油(triglyceride，TG)的水平。左心功能指標采用彩色超聲診斷儀(飛利浦IE33)測量，指標包括左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)及左心室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVESV)，連續(xù)測3個心動周期，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 2組一般臨床資料比較 對照組與AMI組患者在性別比、年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙、高血壓、高血脂間無明顯差異(均P>0.05)，AMI組患者血漿cTnI、CK-MB、ET-1、LVEDV及LVESV明顯較高，而LVEF明顯較低(P<0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較

2.2 4組血漿miR-221-3p、miR-208b-3p比較 與對照組比較，AMI組患者的血漿miR-208b-3p、miR-221-3p表達明顯較高(t=40.794、35.950,P=0.000)。與NSTEMI組比較，STEMI組患者血漿miR-208b-3p、miR-221-3p表達明顯較高(t=4.216、11.282,P=0.000)。見表2。

表2 4組血漿miR-221-3p、miR-208b-3p比較

2.3 不同危險分層的AMI患者血漿miR-221-3p、miR-208b-3p的比較 采用GRCE評分系統(tǒng)對AMI組患者進行危險分層，結(jié)果各危險分層的AMI患者血漿miR-221-3p、miR-208b-3p表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與中危及低危組比較，高危組患者血漿miR-208b-3p、miR-221-3p明顯較高；與低危組相比，中危組患者血漿miR-208b-3p、miR-221-3p明顯較高(P<0.05)。見表3。

表3 3組血漿miR-221-3p、miR-208b-3p表達比較

2.4 AMI組血漿miR-221-3p、miR-208b-3p表達與心肌損傷標志物及左心功能相關性 AMI組患者血漿miR-221-3p、miR-208b-3p與cTnI呈正相關，與LVEF呈負相關(P<0.05)，而與CK-MB、ET-1、LVEDV、LVESV無明顯的相關性(P>0.05)。見表4。

表4 AMI患者血漿miR-221-3p、miR-208b-3p與心肌損傷及左心功能指標的相關性

3 討論

AMI是臨床常見的危急重癥，是心血管病患者高病死率的主要原因之一，是我國重要的公共衛(wèi)生問題[9]。早期診斷AMI并及時進行冠狀動脈介入治療，患者?？色@得良好的預后及生活質(zhì)量[10]。深入研究AMI的分子機制，篩選具有早期診斷價值的血漿標志物，具有重要臨床意義。心肌細胞缺血、缺氧損傷后，心肌細胞內(nèi)蛋白或分子釋放入血，如cTnI、CK-MB及肌紅蛋白等，但特異性均不高，例如其中特異性最好的肌鈣蛋白可以在心力衰竭患者或慢性腎臟疾病患者中長期表達上調(diào)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳等方面控制基因表達，參與機體生長、發(fā)育及衰老等生物學過程，與人類腫瘤、心血管疾病等具有密切關聯(lián)[12]。近年來研究表明，AMI患者血漿某些miR表達水平顯著上調(diào)，并有可能成為AMI新的生物標志物及治療靶點，為臨床的診斷及新型藥物的研發(fā)提供有價值的信息[13]。

miR-221-3p基因位于Xp11.3，編碼一個外顯子。研究表明，miR-221-3p是心臟組織中表達豐度較高的miR，特別是高表達于人動脈粥樣硬化血管的內(nèi)皮細胞內(nèi)膜中，是調(diào)控調(diào)控心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵miR之一[14]。本研究中，AMI組患者的血漿miR-221-3p表達明顯高于對照組，并且STEMI患者水平明顯高于NSTEMI患者，表明AMI患者血漿miR-221-3p表達上調(diào)，目前表達上調(diào)的機制尚不清楚，可能是心肌缺血缺氧，激活磷脂酰肌醇3激酶/AKT信號通路，促進miR-221-3p基因表達[15]。而NSTEMI患者血漿miR-221-3p水平較低的原因可能是不完全梗阻的血管存在部分血流灌注，心肌細胞損傷程度較輕，miR-221-3p釋放入血減少，并且NSTEMI患者炎癥系統(tǒng)激活不明顯，各種炎性因子對心肌細胞的損傷也較輕。目前AMI患者常用的風險評估方法包括GRACE評分、Branunwald分層及TIMI風險評分等，其中GRACE危險評分是最為有效的預測AMI不良心血管事件的工具，能夠預測住院期間及出院半年內(nèi)死亡風險[16]。本研究中，不同危險分層的AMI患者血漿miR-221-3p水平具有顯著差異，危險程度越高，miR-221-3p水平越高。表明miR-221-3p水平的升高可能加重冠脈病變的嚴重程度，增加患者出院短期出現(xiàn)心血管不良事件的發(fā)生概率。有研究報道，miR-221-3p表達上調(diào)能夠促進下游靶基因如P27的表達，促進血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞增殖，加重血管狹窄病變的嚴重程度，增加不良心血管事件的發(fā)生風險[17]。本研究中，AMI患者血漿miR-221-3p表達與cTnI呈正相關(P<0.05)，與LVEF呈負相關(P<0.05)，表明血漿miR-221-3p水平有助于反映心肌損傷嚴重程度及左心功能狀況，有可能成為新的輔助評估心肌損傷程度及左心功能的血漿指標。

miR-208b-3p由P-肌球蛋白重鏈基因內(nèi)含子編碼，在心肌細胞發(fā)育過程中調(diào)控肌球蛋白重鏈的產(chǎn)生。越來越多的證據(jù)表明，miR-208b-3p在心肌細胞發(fā)育、心肌肥厚、心肌細胞凋亡及心肌梗死等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[18,19]。本研究中，AMI組患者的血漿miR-208b-3p表達明顯上調(diào)，其原因可能是miR-208b-3p在心臟組織中顯著富集，而在正常組織表達水平較低，在心肌細胞損傷時其能釋放入血，導致循環(huán)中miR-208b-3p水平升高。此外，本研究中，不同危險分層的AMI患者血漿miR-208b-3p水平具有顯著差異，危險程度越高，miR-208b-3p水平越高，表明miR-208b-3p能夠加重冠脈病變的程度。其原因是在缺血缺氧的刺激下，miR-208b-3p能激活心肌細胞中形成信號級聯(lián)反應，促進下游增殖相關基因的表達，導致冠脈狹窄程度加重[20]。Wang等[21]研究進一步表明，應用右旋美托咪啶能通過抑制miR-208b-3p的表達，降低Wnt信號通路的過度活化，則能減輕心肌缺血/再灌注損傷。此外，AMI患者血漿miR-208b-3p表達與cTnI呈正相關，與LVEF呈負相關，表明血漿miR-208b-3p水平與心肌損傷嚴重程度及左心功能指標具有良好的相關性，有可能成為新的評估心肌損傷程度及左心功能的血漿指標。

綜上所述，AMI患者血漿miR-221-3p、miR-208b-3p水平升高，二者與GRACE評分、cTnI及LVEF有關，有望成為新的評估心肌損傷及左心功能的血漿標志物。但由于樣本例數(shù)有限，二者具體作用機制及臨床預后價值有待進一步深入研究。