叢枝菌根育苗緩解西瓜枯萎病的機(jī)制*

李淑君，王兵爽，王 媛，張舒桓，張夕雯，張曉暉，徐國(guó)華，任麗軒

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210095）

西瓜是世界廣泛栽培的水果，我國(guó)西瓜種植面積和產(chǎn)量分別占世界的52.7%和67.0%[1]。江蘇省種植面積在2016年達(dá)到19.28萬(wàn)hm2，為經(jīng)營(yíng)者帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)效益[2]。近年來(lái)，西瓜種植面積不斷擴(kuò)大，受耕地面積減少的限制，常出現(xiàn)重茬栽培，容易受連作障礙影響，加重作物的病蟲害。西瓜連作病害主要是尖孢鐮刀菌西瓜?；驮斐傻目菸3]，西瓜枯萎病嚴(yán)重時(shí)造成西瓜大量減產(chǎn)[4]。生物防治是可持續(xù)農(nóng)業(yè)防控枯萎病的重要方法[5]，利用具有拮抗作用的微生物來(lái)減少甚至遏制病原菌的數(shù)量，以降低枯萎病的發(fā)病率。叢枝菌根真菌（AMF）是生態(tài)環(huán)境中分布廣泛的一種有益內(nèi)生真菌，能與80%以上的陸生植物建立共生關(guān)系[6]，增強(qiáng)植物抗旱性[7]，促進(jìn)磷素吸收，有效緩解由連作障礙引起的病蟲害，提高宿主植物的抗病性。

西瓜連作枯萎病的發(fā)生與西瓜植株抗病性和根際病原菌數(shù)量密切相關(guān)[8]。在連作土壤中，西瓜形成叢枝菌根后，無(wú)論是嫁接苗還是自根苗，均能顯著提高根系中幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶（phenylanlanine ammonia-lyase，PAL）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）以及過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）的活性，提高對(duì)逆境的反應(yīng)能力[9]。

田間直接接種叢枝菌根菌對(duì)抑制西瓜枯萎病有一定的效果，其作用機(jī)制是改善了西瓜氮、磷、硼、鋅等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，提高抗病性[10]，主要是促進(jìn)了西瓜對(duì)土壤中礦質(zhì)態(tài)磷素的吸收[11]。由于土壤中的磷營(yíng)養(yǎng)和微生物環(huán)境復(fù)雜，田間直接接種叢枝菌根菌對(duì)菌根定殖存在風(fēng)險(xiǎn)，本研究設(shè)想在西瓜育苗期間接種叢枝菌根菌，形成叢枝菌根苗，研究叢枝菌根苗在移栽后生理功能的發(fā)揮及其機(jī)制。叢枝菌根育苗的方法在樹木和其他作物上已經(jīng)成功應(yīng)用[12-13]。作者所在研究組已經(jīng)證實(shí)叢枝菌根育苗能提高西瓜根系防御性酶活性[14]，本研究將進(jìn)一步證實(shí)這些防御性酶在轉(zhuǎn)錄水平上是否有表達(dá)量的變化。此外，根外菌絲分泌的酸性磷酸酶在提高根際土壤酸性磷酸酶活性、促進(jìn)有機(jī)磷水解、提高根際有效磷含量也起著重要作用[15]。叢枝菌根化培育的西瓜苗在移栽后是否能繼續(xù)保持或提高西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性，以提高根系水解和利用土壤中有機(jī)磷的能力，從而提高西瓜抗病能力，尚未可知。本研究將采用叢枝菌根育苗的方法，探討西瓜根系在苗床形成叢枝菌根，移栽后是否在轉(zhuǎn)錄水平上提高西瓜防御性酶編碼基因表達(dá)量，提高西瓜抗病能力；而且在大田中是否可以保持侵染率，并從提高根際有機(jī)磷利用能力方面提高抗病能力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

西瓜品種為早佳-8424（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum and Nakaicv. Zaojia-8424）。

根內(nèi)根孢囊霉（Rhizophagus intraradices，R.i）菌種由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所提供，采用土壤和河沙基質(zhì)，種植玉米和三葉草擴(kuò)繁，產(chǎn)生孢子、菌絲體、土壤和河沙的混合接種劑。

西瓜?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON）由本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病西瓜植株上篩選并保存[16]。病原菌FON為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）活化的西瓜專化型尖孢鐮刀菌，接入馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）溶液，在 28℃220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)7 d，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，尖孢鐮刀菌孢子數(shù)為107CFU·mL-1。用尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基[17]篩選菌株。

西瓜育苗基質(zhì)為作物秸稈、稻殼、木屑、菇渣等有機(jī)固體廢棄物的混合物，發(fā)酵后混合蛭石和珍珠巖無(wú)機(jī)物料。基質(zhì)由淮安柴米河農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 土培盆栽試驗(yàn) 盆栽試驗(yàn)設(shè)置在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院溫室。共設(shè)置4個(gè)處理：（1）-AMF-FON：非叢枝菌根育苗，不接種FON（對(duì)照）；（2）+AMF-FON：叢枝菌根育苗，不接種FON；（3）-AMF+FON：非叢枝菌根育苗，接種FON；（4）+AMF+FON：叢枝菌根育苗，接種FON。重復(fù)3次。土壤采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗(yàn)基地，經(jīng)γ-射線輻照滅菌。土壤基本理化性狀為：堿解氮55.8 mg·kg-1，有效磷4.2 mg·kg-1，速效鉀132 mg·kg-1，pH 7.8。試驗(yàn)中西瓜苗在50孔的育苗盤培育，用西瓜專用育苗基質(zhì)，叢枝菌根化育苗的處理在育苗盤中接種叢枝菌根菌菌種，非菌根苗接種等量的滅菌叢枝菌根菌菌種和菌種濾液。育苗20 d時(shí)，移栽至裝有無(wú)菌低磷土的盆缽中，每盆移栽5株。移栽后采用灌根法接種FON孢子懸浮液，分別在移栽后第5天、第10天、第15天接種FON，每株澆灌5 mL。移栽20天后，處理3（-AMF+FON）的西瓜苗出現(xiàn)枯萎病癥狀，收獲。收獲時(shí)，小心將西瓜植株完整取出，抖去與根系分離的土壤，收集根際土壤待測(cè)枯萎病病原菌數(shù)量，取植株洗凈，待測(cè)生物量、酶活性、基因表達(dá)量。

盆缽中土壤施肥量為：N（Ca（NO3）2·4H2O）1.68 g·kg-1，P（KH2PO4）0.68 g·kg-1，K（K2SO4）0.24 g·kg-1，Mg（MgSO4·7H2O）0.51 g·kg-1，F(xiàn)e（FeSO4·7H2O）0.025 g·kg-1，Zn（ZnSO4·7H2O）0.022 g·kg-1。

1.2.2 大田試驗(yàn) 大田試驗(yàn)研究叢枝菌根育苗對(duì)西瓜根系利用有機(jī)磷及抗枯萎病的影響。試驗(yàn)設(shè)置在江蘇省句容市（119°17′E，31°95′N），土壤基本理化性狀為堿解氮72.68 mg·kg-1，有效磷14.09 mg·kg-1，速效鉀55 mg·kg-1，pH 4.24。試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理：非叢枝菌根育苗（-AMF）和叢枝菌根育苗（+AMF）。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。將接種物以每缽5 000接種勢(shì)單位分別置于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，對(duì)照則加入等量的滅菌接種物，并與缽中土壤混勻后播種。待西瓜幼苗長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)移栽入大田，小區(qū)面積120 m2，每666.7 m2定植 650株，試驗(yàn)期間除草、灌水等管理正常，西瓜成熟時(shí)收獲。收獲時(shí)，按照五點(diǎn)法采集西瓜、土壤樣品，每小區(qū)采集5個(gè)植株樣品，采集時(shí)將西瓜根系從土壤中挖出，用抖土法收集西瓜根際土壤待測(cè)，將每株西瓜所有果實(shí)稱重計(jì)產(chǎn)。

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 植株生物量及磷吸收量 盆栽試驗(yàn)收獲后，采集植株地上部和地下部的鮮樣，105℃殺青，70℃烘至恒重，測(cè)定干物質(zhì)量。稱取烘干樣0.100 0 g，采用硫酸-過(guò)氧化氫消煮，取消煮液采用鉬銻抗比色法測(cè)定全磷含量[12]，計(jì)算磷吸收量。

1.3.2 抗性相關(guān)基因表達(dá)量 從葫蘆科基因組網(wǎng)站（http://cucurbitgenomics.org）查得西瓜基因組抗性相關(guān)酶幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和PAL酶基因序列，并設(shè)計(jì)引物（表1）[18]。RNA提取和cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）分析參照文獻(xiàn)[19]。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for PCR amplification

1.3.3 西瓜根系酶活性 分別用幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 土壤酸性磷酸酶活性 采用磷酸苯二鈉法測(cè)定[12]，于660 nm波長(zhǎng)處比色。

1.3.5 土壤有效磷含量 采用鉬銻抗比色法測(cè)定[12]。

1.3.6 菌根侵染率 采用曲利苯藍(lán)染色法[14]。菌根侵染率/%=Σ（0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+···+100%×根段數(shù)）/總根段數(shù)。

1.3.7 枯萎病調(diào)查方法及枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 0級(jí)：健康植株，無(wú)發(fā)病癥狀；1級(jí)：葉片或莖蔓由下而上萎蔫，萎蔫面積占全株的1/4或1/4以下； 2級(jí)：葉片或莖蔓由下而上萎蔫，萎蔫面積占全株的1/4～1/2，莖蔓上有琥珀色膠狀物；3級(jí)：葉片或莖蔓由下而上萎蔫，萎蔫面積占全株的1/2以上，莖蔓上有琥珀色膠狀物；節(jié)間變短，下部病莖表面產(chǎn)生白色或粉紅色霉層，阻礙發(fā)育；4級(jí)：整株枯萎死亡。

病情指數(shù)/%=Σ（級(jí)數(shù)×該級(jí)數(shù)發(fā)病株數(shù)）/（總調(diào)查數(shù)×最高級(jí)數(shù)）×100

發(fā)病率/%=發(fā)病株數(shù)/總調(diào)查數(shù)×100

防治效果/%=（對(duì)照的病情指數(shù)-接種AM真菌的病情指數(shù)）/對(duì)照的病情指數(shù)×100

1.3.8 土壤中西瓜枯萎病病原菌數(shù)量和AM真菌孢子數(shù) 用選擇培養(yǎng)基稀釋分離法測(cè)定土壤中枯萎病病原菌數(shù)量[19]。采用濕篩傾注-蔗糖離心法，體視鏡（OLYMPUS MVX10，南京奧利科學(xué)儀器有限公司，南京）下計(jì)數(shù)AM真菌孢子數(shù)[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與圖表處理，采用SPSS 17.0單因素方差分析（One-way ANOVA）的圖基（Tukey）方法進(jìn)行不同處理的差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平為P≤0.05。

2 結(jié) 果

2.1 叢枝菌根育苗對(duì)西瓜枯萎病發(fā)病率的影響

表2 表明叢枝菌根育苗可有效抑制西瓜枯萎病。在接種FON處理下，與非叢枝菌根育苗處理相比，叢枝菌根育苗的西瓜植株發(fā)病率降低了22.22%，病情指數(shù)降低了23.15%，防治效果達(dá)到36.23%。接種FON的西瓜根際土壤中發(fā)現(xiàn)了大量的尖孢鐮刀菌，叢枝菌根育苗顯著降低西瓜根際土壤病原菌數(shù)量。

表2 叢枝菌根育苗對(duì)西瓜枯萎病的影響Table 2 Effects of inoculation of arbuscular mycorrhizae at the seedling stage on Fusarium wilt of watermelon

2.2 叢枝菌根育苗對(duì)西瓜植株生物量積累和菌根侵染率的影響

如圖1所示，接種FON處理時(shí)，叢枝菌根育苗的西瓜地下部干物質(zhì)量顯著高于非叢枝菌根育苗處理，表3表明西瓜根際接種FON對(duì)西瓜根系菌根侵染率無(wú)影響。

表3 西瓜根系菌根侵染率Table 3 Arbuscular mycorrhizal colonization rate of watermelon root

2.3 叢枝菌根育苗對(duì)西瓜基因表達(dá)量的影響

ClPR4、ClPR5和ClPR6是西瓜中編碼幾丁質(zhì)酶基因，如圖2a所示，與對(duì)照處理相比，叢枝菌根苗接種FON時(shí)，顯著提高西瓜根系和葉片ClPR4表達(dá)量；圖2b所示，叢枝菌根苗接種FON時(shí)，西瓜根系ClPR5表達(dá)量顯著提高，為非叢枝菌根苗不接種FON處理的2倍；叢枝菌根育苗同時(shí)接種FON處理時(shí)，西瓜根系和葉片ClPR5表達(dá)量較其他處理顯著提高。圖2c表明叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，西瓜葉片ClPR6表達(dá)量顯著高于其他處理。

ClGlu1、ClGlu2和ClGlu3是西瓜中編碼β-1，3-葡聚糖酶的基因。圖3a表明接種FON處理時(shí)西瓜根系ClGlu1表達(dá)量顯著高于對(duì)照，叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，西瓜根系ClGlu1表達(dá)量顯著高于對(duì)照，相對(duì)表達(dá)量提高了38倍；叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，西瓜葉片ClGlu1表達(dá)量顯著高于其他處理。圖3c表明叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，西瓜葉片ClGlu3表達(dá)量顯著高于其他處理，分別為叢枝菌根育苗不接種FON、單接種FON和對(duì)照處理的1.4倍、1.3倍、71倍；叢枝菌根育苗不接種FON或單接種FON時(shí)，西瓜根系ClGlu3表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，且叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，根系ClGlu3表達(dá)量顯著高于其他處理。

ClPAL4、ClPAL8和ClPAL11是西瓜中編碼苯丙氨酸解氨酶的基因。圖4a表明接種FON處理時(shí)，根系ClPAL4表達(dá)量顯著提高；叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，西瓜根系及葉片ClPAL4表達(dá)量顯著高于其他處理。圖4b表明，叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，西瓜葉片ClPAL8相對(duì)表達(dá)量較其他處理顯著提高。圖4c表明，叢枝菌根育苗接種FON處理時(shí)，西瓜根系ClPAL11表達(dá)量顯著高于其他處理。

2.4 叢枝菌根育苗對(duì)西瓜植株抗性相關(guān)酶活性的影響

如圖5a所示，與對(duì)照相比，接種AM菌提高了西瓜根系幾丁質(zhì)酶活性。圖5b所示，在西瓜根際接種FON時(shí)，叢枝菌根育苗可提高西瓜葉片β-1，3葡聚糖酶活性，較非叢枝菌根育苗處理提高27.3%。圖5c所示，叢枝菌根育苗接種FON、叢枝菌根育苗不接種FON以及單接種FON處理時(shí)，西瓜葉片苯丙氨酸解氨酶活性均顯著高于對(duì)照處理，其中叢枝菌根育苗不接種FON處理時(shí)苯丙氨酸解氨酶活性為對(duì)照處理的1.3倍。

2.5 叢枝菌根育苗對(duì)西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性的影響

如圖6所示，大田試驗(yàn)表明，與非叢枝菌根育苗處理相比，叢枝菌根育苗顯著提高了西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性，與非叢枝菌根育苗相比，提高了7.3%（圖6a），并顯著提高西瓜根際土壤有效磷含量。

2.6 叢枝菌根育苗對(duì)西瓜發(fā)病率的影響

如圖7所示，叢枝菌根育苗顯著提高西瓜根系菌根侵染狀況（圖7a、圖7b、圖7c），并且叢枝菌根育苗顯著提高根際土壤及非根際土壤孢子數(shù)（圖7d），改善西瓜根系環(huán)境，顯著降低了西瓜發(fā)病率（圖7e）。

2.7 叢枝菌根育苗對(duì)成熟期西瓜生物量及磷吸收量的影響

如表4所示，大田試驗(yàn)表明，叢枝菌根育苗處理下，西瓜地上部干物質(zhì)量顯著高于非叢枝菌根育苗處理；叢枝菌根育苗顯著降低西瓜根、莖、葉、瓜皮的磷吸收量；叢枝菌根育苗處顯著提高西瓜單瓜生物量。

3 討 論

植物形成叢枝菌根提高抗生物脅迫和非生物脅迫的能力。叢枝菌根植物提高抗逆能力的可能機(jī)制有：

3.1 提高植物抗性相關(guān)酶活性

幾丁質(zhì)和葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶通過(guò)降解菌絲細(xì)胞壁，破壞菌絲端部生長(zhǎng)而使其頂端細(xì)胞壁變薄，導(dǎo)致病原體死亡而降低病害發(fā)生[20]。苯丙氨酸解氨酶催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，進(jìn)一步合成植保素、木質(zhì)素和酚類等抗病性次生代謝物[21]。葉片是PAL酶活性高效表達(dá)的部位，PAL酶活性表達(dá)呈周期性變化，PAL酶活性與枯萎病抗性呈正相關(guān)[22]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，西瓜在苗期形成叢枝菌根，誘導(dǎo)表達(dá)的抗性相關(guān)酶基因，在移栽大田后表達(dá)量仍處于上調(diào)的水平，具有較高的抗枯萎病能力。主要有根系幾丁質(zhì)酶編碼基因ClPR4、ClPR5上調(diào)（圖2a，圖2b），根系β-1，3葡聚糖酶編碼的ClGlu1基因上調(diào)（圖3a），以及編碼PAL酶的ClPAL4基因在西瓜葉片及根系中的表達(dá)量均上調(diào)（圖4a）。而且通過(guò)對(duì)菌根豌豆根系中病原菌Aphanomyces euteiches的肽酶活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的關(guān)系研究，證實(shí)了真菌提高植物的抗病性并不是減少了病原菌的生物量，而是抑制了病原菌酶的活性[23]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，培育叢枝菌根苗，西瓜移栽后能夠保持抗病性，顯著降低西瓜枯萎病發(fā)病率及病情指數(shù)（表2）。西瓜在發(fā)生枯萎病害時(shí)，組織內(nèi)的相關(guān)抗病基因表達(dá)量提高，AM真菌的定殖也上調(diào)西瓜根系ClaPR4、ClaPR5、ClaGlu3和ClaPAL4的表達(dá)量，提高西瓜的抗病性。

3.2 促進(jìn)植物礦質(zhì)養(yǎng)分吸收，提高植物抗病性

AM真菌與植物根系共生可產(chǎn)生互惠互利的生態(tài)效應(yīng)，其根外菌絲可增強(qiáng)對(duì)土壤養(yǎng)分和水分的吸收，尤其是有效提高了植物組織中的磷含量，提高植物抗逆性。植物磷營(yíng)養(yǎng)的改善對(duì)植物的抗逆能力有顯著的提高效果[24-25]，叢枝菌根通過(guò)菌絲體促進(jìn)根系對(duì)水分和土壤礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收[26]，提高植物抗逆能力。酸性磷酸酶催化有機(jī)磷水解，產(chǎn)生植物可吸收的無(wú)機(jī)磷。植物根系酸性磷酸酶基因表達(dá)量上調(diào)，提高根系分泌酸性磷酸酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)根際土壤酸性磷酸酶活性，從而提高植物利用有機(jī)磷的能力[27]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，叢枝菌根化育苗顯著提高根際土壤酸性磷酸酶活性（圖6a），水解根際有機(jī)磷，提高根際土壤中磷的有效性，也提高了根際土壤中有效磷含量（圖6b）。因此，培育叢枝菌根西瓜苗，在移栽后仍可有效提高西瓜根際土壤酸性磷酸酶活性，增強(qiáng)根系利用有機(jī)磷的能力，改善西瓜磷營(yíng)養(yǎng)，從而提高西瓜抗枯萎病的能力。

3.3 其他可能機(jī)制

（1）抑制根際環(huán)境中的病原菌數(shù)量。番茄形成叢枝菌根，顯著降低根際土壤中番茄?；图怄哏牭毒鷶?shù)量，有效防控番茄枯萎病[28]。（2）調(diào)控植物根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。叢枝菌根育苗提高了西瓜根際土壤的孢子數(shù)（圖7e），改善了根際微生物環(huán)境。

4 結(jié) 論

西瓜在發(fā)生枯萎病害時(shí)，AM真菌的定殖通過(guò)上調(diào)西瓜根系ClPR4、ClPR5、ClGlu3和ClPAL4的表達(dá)量，提高抗病相關(guān)酶活性，從而提高西瓜的抗病性；叢枝菌根育苗能夠改善根際微生物環(huán)境，并通過(guò)提高根際土壤酸性磷酸酶活性促進(jìn)難溶磷的水解，提高土壤有效磷含量，從而促進(jìn)西瓜對(duì)養(yǎng)分的吸收，提高西瓜抗病能力，降低西瓜枯萎病發(fā)病指數(shù)，有效防控枯萎病。