馬褂木母樹林與不同來源無性系的遺傳多樣性比較分析

祝園青，白天道，王曉波，胥 猛，蔣維昕*，黃壽先

（1.廣西大學(xué) 林學(xué)院/國(guó)家林業(yè)與草原局中南速生材繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；2.全州縣咸水林場(chǎng)，廣西全州 541500；3.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

【研究意義】鵝掌楸屬（Liriodendron）樹種隸屬木蘭科（Magnoliaceae），大部分已經(jīng)滅絕，現(xiàn)存2 個(gè)種，中國(guó)馬褂木（Liriodendron chinense（Hemsl.）Sarg.）和北美鵝掌楸（L.tulipiferaL.），因其葉形似馬褂又似鵝掌而得名[1-2]。其樹干挺拔，樹姿優(yōu)美，是優(yōu)良的用材及園林綠化樹種。中國(guó)馬褂木星散間斷分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣西、陜西、四川、貴州、云南等地，越南北部也有分布，資源相對(duì)較為稀少，屬漸危種，已被列為國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)樹種[3]。與中國(guó)馬褂木瀕危狀態(tài)不同，北美鵝掌楸連續(xù)成片分布于美國(guó)東部各州及加拿大東南部地區(qū)，其群體規(guī)模普遍較大，資源保存較為豐富[3-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于鵝掌楸屬2個(gè)樹種的用途及其分布特性，國(guó)內(nèi)學(xué)者先后對(duì)其開展較多的研究，主要涉及系統(tǒng)地理進(jìn)化、群體遺傳多樣性、資源收集保存與評(píng)價(jià)、雜交育種、栽培技術(shù)等。在系統(tǒng)進(jìn)化與遺傳多樣性方面，劉玉壺[7]于1984 年在木蘭科分類系統(tǒng)的初步研究中利用形態(tài)標(biāo)記對(duì)馬褂木進(jìn)行了形態(tài)學(xué)水平上的比較，表明中國(guó)馬褂木較原始，而北美鵝掌楸是次生的。Parks和Wendel[8]利用等位酶標(biāo)記和RFLP技術(shù)比較中國(guó)馬褂木和北美鵝掌楸遺傳多樣性，研究得出中國(guó)馬褂木的遺傳多樣性低于北美鵝掌楸的遺傳多樣性。基于分子標(biāo)記群體遺傳研究表明，中國(guó)馬褂木在天然群體中具有較高的遺傳多樣性[9-12]，且種群間的遺傳分化程度較高[13]。在馬褂木雜交育種方面，Xu 等[14]表明馬褂木在自由授粉過程中，存在著自交、種內(nèi)交配和種間交配等多種交配方式，研究發(fā)現(xiàn)雜交馬褂木的遺傳多樣性較高，且馬褂木親本遺傳距離及子代雜合度可能并非馬褂木雜種優(yōu)勢(shì)形成的主要原因[15-17]，優(yōu)良雜種后代可能有較多的遺傳信息來自北美鵝掌楸[18]。因此，開展中國(guó)馬褂木及北美鵝掌楸優(yōu)良遺傳資源收集和保存，有助于該屬樹種的雜交改良和擴(kuò)繁利用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】遺傳多樣性評(píng)價(jià)是良種選育的前提和基礎(chǔ)，開展馬褂木優(yōu)良種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)，以為其科學(xué)管理和有效利用提供指導(dǎo)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于此，本研究利用SSR分子標(biāo)記，對(duì)廣西全州縣咸水林場(chǎng)收集保存的中國(guó)馬褂木及北美鵝掌楸嫁接優(yōu)樹以及實(shí)生采種母樹林進(jìn)行遺傳多樣性分析，以為其育種利用及良種生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于廣西桂林市全州縣咸水林場(chǎng)，地理位置為E110°42'12″，N25°47'27″，地貌主要為低山、丘陵，土壤以紅壤土為主。全年光照充足，雨量充沛，年平均氣溫17.9 ℃，年平均降雨量1 454 mm，年均相對(duì)濕度78%，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候[19]。

試驗(yàn)材料分為兩部分，第一部分是中國(guó)馬褂木（LC）及北美鵝掌楸嫁接優(yōu)樹（LT）（2019年3月嫁接）。其中LC 共9 個(gè)無性系，接穗材料來源于咸水林場(chǎng)種源試驗(yàn)林選育的優(yōu)良單株。LT 共10 個(gè)無性系，接穗材料來源于南京林業(yè)大學(xué)北美鵝掌楸種源試驗(yàn)林。砧木為廣西全州種源1 年生實(shí)生苗。第二部分為中國(guó)馬褂木全州種源人工林（LCS），面積共10 hm2，造林時(shí)間2011年3月，因其生長(zhǎng)表現(xiàn)較好且已進(jìn)入開花結(jié)實(shí)期，于2018年初步通過樣方調(diào)查、去劣疏伐、撫育施肥等措施，將其改建為采種母樹林。在全林范圍內(nèi)隨機(jī)選擇了53 株母樹作為樣本，株間間隔30 m 以上。此外，為了驗(yàn)證SSR 擴(kuò)增的穩(wěn)定性及嫁接管理過程中是否出現(xiàn)錯(cuò)漏，針對(duì)部分優(yōu)樹無性系采集了2個(gè)樣本（嫁接分株），共計(jì)獲得35個(gè)樣本（表1）。

表1 嫁接優(yōu)樹基本信息Tab.1 Basic information of grafting plus trees

1.2 DNA的提取及PCR擴(kuò)增

采用改良CTAB 法提取馬褂木葉片的DNA[20]，用微量核酸蛋白檢測(cè)儀（ScanDrop200，耶拿，德國(guó)）進(jìn)行DNA 濃度和純度測(cè)定，并用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性?；谖墨I(xiàn)檢索[20]，引物初篩，最終獲得擴(kuò)增穩(wěn)定，多態(tài)性較高的25 個(gè)SSR 位點(diǎn)（表2），SSR 引物由生工生物科技有限公司（上海）合成。PCR擴(kuò)增體系參見文獻(xiàn)[20]。

表2 SSR引物基本信息Tab.2 Information table of of SSR primers

續(xù)表Continued tab.

1.3 數(shù)據(jù)處理

將PCR 產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺膠電泳并銀染，拍照保存。利用凝膠DNA 片段識(shí)別軟件GelAnalyzer 19.1（http://www.gelanalyzer.com/index.html）對(duì)每張膠圖上的目的條帶數(shù)量及片段大小進(jìn)行判讀，將判讀結(jié)果導(dǎo)出為Excel文件。利用POPGENE32[21]計(jì)算各群體的等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù)（ne）、Shannon多樣性指數(shù)（I），各位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He），基因多樣度（Nei）。利用群體遺傳分析軟件GenAlEx6.5[22]AMOVA計(jì)算F-統(tǒng)計(jì)量和基因流（Nm）。利用R3.6.1[23]及其相關(guān)R數(shù)據(jù)包[24-25]分析參試馬褂木材料的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、計(jì)算個(gè)體遺傳距離并進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性分析結(jié)果顯示（圖1），北美鵝掌楸嫁接無性系（LT）的等位基因數(shù)（na）為4.840 0，有效等位基因數(shù)（ne）為3.338 6，香農(nóng)信息指數(shù)（I）為1.271 0，觀測(cè)雜合度（Ho）為0.399 3，期望雜合度（He）為0.662 7，基因多樣度（Nei）為0.642 6，高于中國(guó)馬褂木嫁接無性系（LC）的遺傳多樣性（na=4.040 0，ne=2.828 9，I=1.108 0，Ho=0.359 6，He=0.611 5，Nei=0.591 0）。相較于嫁接無性系LT 和LC，中國(guó)馬褂木母樹林（LCS）遺傳多樣性較低（na=4.160 0，ne=2.450 2，I=0.963 4，Ho=0.313 5，He=0.514 1，Nei=0.508 8）。

對(duì)遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（圖1），發(fā)現(xiàn)除na，Ho外，其他指標(biāo)在群體間均有顯著差異。

圖1 馬褂木優(yōu)樹無性系與母樹林遺傳變異參數(shù)比較Fig.1 Comparison of genetic variation parameters between superior clones and seed stands of L.chinense

2.2 遺傳分化

AMOVA 分析表明，3 組材料（LCS、LC 及LT）間的Fst值為0.143，即有14.3%的遺傳變異存在于群體間，大部分變異（85.7%）存在于群體內(nèi)，說明群體間存在中等程度的遺傳分化[26]。馬褂木群體間的存在一定程度的基因流（Nm=1.496）可能是其維持中等程度分化原因之一。參試3組材料間的成對(duì)遺傳分化系數(shù)顯示（表4），LC 和LT 之間的遺傳分化系數(shù)最低，其次是LT 和LCS 之間，而LC 和LCS 之間的遺傳分化系數(shù)最高。

表4 參試3組材料間的成對(duì)遺傳分化系數(shù)（Pairwise Fst）Tab.4 The coefficient of genetic differentiation between populations

表3 馬褂木材料的遺傳分化程度分析Tab.3 Genetic differentiation of L.chinense

基于個(gè)體共祖系數(shù)的遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，參試材料的共祖群體數(shù)（K）為3 時(shí)，其最小交叉熵值出現(xiàn)拐點(diǎn)（圖2A），由此認(rèn)為供試材料可分為3 個(gè)組。共祖系數(shù)圖顯示（圖2B），第一類群主要由LCS 構(gòu)成（紅色），第二類群主要由LC 構(gòu)成（綠色），第三類則主要為L(zhǎng)T（藍(lán)色）。需要指出的是，在K=2 時(shí)，發(fā)現(xiàn)LC 和LT中個(gè)體的共祖比例更高（藍(lán)色）。這可能意味著用于分析的SSR位點(diǎn)可能與生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因有著密切關(guān)聯(lián)，在人為表型趨同選擇（均為種源試驗(yàn)林中表型優(yōu)良的個(gè)體）下，使得LC 和LT 個(gè)體的等位基因及其頻率具有較高的相似性，一定程度上掩蓋自然狀態(tài)下兩者的真實(shí)遺傳差異。

圖2 參試馬褂木材料群體結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Population structure analysis of L.chinense

基于Ward 最小方差法對(duì)個(gè)體間遺傳距離[27]進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)聚類數(shù)等于3 時(shí)，可將參試的3 組材料（LCS、LC、LT）較好的區(qū)分（圖3）。除LT-MSL 2 與母樹林聚在一起，LT-MSL 1，LT-MSL 3 與中國(guó)嫁接優(yōu)樹聚在一起外，同一來源的基因型大多聚為一類。同時(shí)，從遺傳距離上看，LC和LT距離更近，聚在一起，這與上述推測(cè)一致。

圖3 參試中國(guó)馬褂木及北美鵝掌楸個(gè)體的聚類（Ward.D2）Fig.3 Hierarchical cluster of individuals of L.chinense and L.tulipifera（Ward.D2）

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳多樣性

豐富的遺傳多樣性是林木群體遺傳改良的前提和基礎(chǔ)。本研究利用25對(duì)SSR引物對(duì)中國(guó)馬褂木和北美鵝掌楸嫁接無性系，以及中國(guó)馬褂木種源人工母樹林進(jìn)行遺傳多樣性比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)母樹林的遺傳多樣性（I=0.963 4，He=0.514 1）低于優(yōu)樹無性系；而優(yōu)樹無性系中北美鵝掌楸的遺傳多樣性（I=1.271 0，He=0.662 7）高于中國(guó)馬褂木（I=1.108 0，He=0.611 5）。與羅光佐[28]等利用RAPD 技術(shù)和李康琴[29]利用SSR 分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)北美鵝掌楸的遺傳多樣性在天然、種源群體均高于中國(guó)馬褂木的結(jié)果一致。表明中國(guó)馬褂木異交水平普遍低于北美鵝掌楸。推測(cè)主要由于中國(guó)馬褂木呈星散分布，居群間隔離較大，基因流動(dòng)相對(duì)較少，同時(shí)居群內(nèi)個(gè)體數(shù)量普遍較少，加劇了居群內(nèi)個(gè)體的近交及自交程度，使得純合位點(diǎn)增加，遺傳多樣性下降。相反，北美鵝掌楸呈大面積連續(xù)分布，居群間基因流動(dòng)頻繁，異交更為充分。而從中國(guó)馬褂木嫁接無性系與母樹林比較來看，盡管無性系樣本數(shù)較少，在觀測(cè)等位基因數(shù)上低于母樹林，但其觀測(cè)及期望雜合度、香農(nóng)指數(shù)等指標(biāo)等均高于母樹林，這表明表型優(yōu)良馬褂木個(gè)體可能更多來自異交個(gè)體，即馬褂木具有明顯的近交或自交衰退[30]。

馬褂木作為國(guó)家Ⅱ級(jí)瀕危保護(hù)樹種，盡管其遺傳多樣性不如北美鵝掌楸，但與同為木蘭科的珍稀樹種紅花玉蘭（Magnolia wufengensis）相比，其遺傳多樣性整體高于紅花玉蘭（I=0.304 2，He=0.248 8）[31]，且也明顯高于同科的武當(dāng)木蘭（Magnolia sprengeri）的種群遺傳多樣性（I=0.198，He=0.128）[32]。中國(guó)馬褂木具有較高遺傳多樣性的原因可能是馬褂木屬于孑遺植物，歷史悠久，個(gè)體生命周期長(zhǎng)，在進(jìn)化過程中積存了較高水平的遺傳變異，且存在著高水平的地理分化。中國(guó)東、西部的馬褂木也可能起源于不同的避難所，在冰期后再向不同方向擴(kuò)散，形成了豐富的多樣性[33]。此外，其維持相對(duì)較高雜合度的重要原因可能與其強(qiáng)烈的近交、自交衰退效應(yīng)有關(guān)，由于環(huán)境對(duì)近/自交子代強(qiáng)烈的選擇淘汰作用，使得最終成林植株多數(shù)來自異交個(gè)體，使得林分（通過樣本檢測(cè)）維持著一定水平的雜合度。而近交、自交子代的大量淘汰，也進(jìn)一步解釋了當(dāng)前中國(guó)馬褂木天然群體普遍規(guī)模較小的原因。

3.2 遺傳分化

AMOVA 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參試材料的Fst值為0.143，說明組內(nèi)的遺傳變異程度較高，組間的遺傳分化程度相對(duì)較低。馬褂木組間存在較高基因流（Nm=1.496），高于前人對(duì)馬褂木天然群體研究的結(jié)果（Nm=1.044）[11]。這與中國(guó)馬褂木和北美鵝掌楸存在較大的地理隔離矛盾，推測(cè)造成這種組間基因流偏高和分化較小的原因可能并非完全來自居群間的花粉流動(dòng)，而與人為基于表型的趨同選擇有關(guān)，LC 和LT 無性系均選自種源試驗(yàn)林生長(zhǎng)表現(xiàn)優(yōu)良（樹高及胸徑較大，樹干較通直圓滿）的個(gè)體，LCS 則來自單一種源天然林（廣西全州）優(yōu)樹子代，在基因構(gòu)成上與前兩組差異較大，同時(shí)參試SSR 位點(diǎn)可能與控制這些人為偏好的性狀的基因緊密關(guān)聯(lián)（連鎖），使得LC 和LT 的SSR 基因及基因型頻率相對(duì)于LCS 群體更為相似，進(jìn)而造成兩者遺傳分化較小的現(xiàn)象。

基于個(gè)體遺傳距離的聚類結(jié)果與組間分化水平基本一致，LCS 獨(dú)立一組，優(yōu)樹無性系LT、LC 各一組，但距離更近。有研究表明，北美鵝掌楸與中國(guó)馬褂木東部種源的遺傳分化小于中國(guó)馬褂木東西部種源間的差異，從進(jìn)化上北美鵝掌楸介于中國(guó)馬褂木東西部種群分化之間[34]。這與組間成對(duì)分化系數(shù)變化趨勢(shì)一致。因此，LC 中部分無性系來自東部種源可能是造成其與LT遺傳上更近的原因之一。Shen[35]的研究表明，馬褂木在中國(guó)東部和西部是分離的2個(gè)類群，在歷史上雖然有一定的基因交流，但隨著第四紀(jì)氣候的波動(dòng)，生境和擴(kuò)散廊道被暖溫帶常綠林所占據(jù)，這可能使得馬褂木的生境變得支離破碎，加劇了東西部種群的分化，最終形成了如今星散分布于部分山區(qū)的局面。并且隨著近年來人們的亂砍濫伐，對(duì)馬褂木天然群體造成了一定的破壞，人為的選擇也加劇了馬褂木種群的分化。需要指出的是，其中LT中的LT-MSL 2與LCS聚為一組，LT-MSL 1，LT-MSL 3與LC 聚為一組，可能原因除了其自生遺傳特性與中國(guó)馬褂木較接近外，不排除錯(cuò)把緊靠砧木接口的萌條當(dāng)作了接穗的可能性。