杞菊地黃膠囊防治激光性視網(wǎng)膜損傷的作用機(jī)制：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討

張目 于文洲

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的常見并發(fā)癥，是中老年人視力下降的主要原因之一[1]。視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)是DR的重要治療手段，能有效封閉和預(yù)防新生血管形成, 促進(jìn)出血吸收。但是，激光在治療的同時也是一種創(chuàng)傷性技術(shù),會破壞正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及視網(wǎng)膜屏障，引起脈絡(luò)膜缺血、炎癥以及新生血管形成等醫(yī)源性損傷[2]。目前，臨床上缺乏有效防治激光性視網(wǎng)膜損傷的西醫(yī)措施，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的不斷發(fā)展及臨床應(yīng)用的不斷深入，中醫(yī)藥防治激光性視網(wǎng)膜損傷的臨床療效已逐漸被大家所認(rèn)可，因此尋求安全有效的中藥方劑用于防治激光性視網(wǎng)膜損傷具有重要的臨床意義。中醫(yī)認(rèn)為激光性視網(wǎng)膜損傷的病機(jī)屬于“熱毒郁結(jié)，肝腎陰虛”?；谏鲜稣J(rèn)識，我們選擇具有滋腎養(yǎng)肝、清肝明目功效的杞菊地黃膠囊作為防治激光性視網(wǎng)膜損傷的代表方應(yīng)用于臨床，并取得顯著療效。但是，杞菊地黃膠囊防治激光性視網(wǎng)膜損傷的具體作用機(jī)制尚未可知。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新興技術(shù)，它將系統(tǒng)生物學(xué)和計算生物學(xué)相結(jié)合，用來研究多組分和多目標(biāo)制劑[3]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)知識預(yù)測杞菊地黃膠囊防治激光性視網(wǎng)膜損傷的潛在機(jī)制，為今后激光性視網(wǎng)膜損傷的治療及相關(guān)機(jī)制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 杞菊地黃膠囊活性成分與靶點篩選基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[4]，獲取杞菊地黃膠囊的活性成分及其潛在靶點，通過口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18[5]，篩選出有效成分，并根據(jù)既往文獻(xiàn)補(bǔ)充藥物的有效成分，然后依據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)標(biāo)準(zhǔn)確定對應(yīng)基因名稱。

1.2 激光性視網(wǎng)膜損傷相關(guān)治病靶點的篩選在Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank3.0數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 5.0數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org)以“l(fā)aser induced retinal injury”為關(guān)鍵詞檢索激光性視網(wǎng)膜損傷的潛在靶點，并將潛在靶點導(dǎo)入 Uniport數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)及無法標(biāo)準(zhǔn)化靶點基因后整合匯總，作為疾病的潛在靶點基因。

1.3 藥效靶點及其蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建運用韋恩圖選取藥物靶點與疾病靶點的交集作為藥效靶點，再將這些藥效靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進(jìn)行分析，在結(jié)果頁面下載TSV格式文件，將文件輸入到Cytoscape3.7.2軟件，在新的頁面選擇“degree”，其余默認(rèn)選擇，最終點擊Apply建立蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點代表蛋白，節(jié)點之間連接線的粗細(xì)與蛋白質(zhì)之間的相關(guān)作用強(qiáng)度呈正相關(guān)。

1.4 靶點基因的功能富集分析Metascape平臺(http://metascape.org)整合了京都基因與基因組百科全書(KEGG)、基因本體(GO)、Uniprot等多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫，可對靶點進(jìn)行GO與KEGG富集分析，因為其數(shù)據(jù)每月更新一次，保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[6-7]。將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行GO及KEGG分析，物種選擇人類(homo sapiens,human)，利用微生信工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制相關(guān)條形圖和氣泡圖進(jìn)行結(jié)果可視化。本研究的設(shè)計流程圖見圖1。

圖1 杞菊地黃膠囊對激光性視網(wǎng)膜損傷治療作用的分析設(shè)計流程圖

2 結(jié)果

2.1 杞菊地黃膠囊活性成分與靶點在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺數(shù)據(jù)庫中，通過口服生物利用度和類藥性參數(shù)篩選后，獲得139個活性成分，其中枸杞45個，菊花20 個，熟地2個，茯苓15個，山茱萸20個，山藥16個，澤瀉10個，牡丹皮11個,將活性成分對應(yīng)的靶點導(dǎo)入 Uniprot 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，完善基因信息，刪除無注釋及重復(fù)靶點后，得到238個成分靶點，口服生物利用度排序前9位成分靶點見表1。

表1 杞菊地黃膠囊口服生物利用度排序前9位成分靶點

2.2 激光性視網(wǎng)膜損傷相關(guān)靶點在TTD、Drugbank3.0、DisGeNET 5.0數(shù)據(jù)庫檢索激光性視網(wǎng)膜損傷相關(guān)靶點，匯總所有數(shù)據(jù)庫后去除重復(fù)值，獲得相關(guān)疾病靶點911個，如：腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)-6、TP53、IL-10等。

2.3 藥效靶點及PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將藥物活性成分與疾病共同的135個靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，將String數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果通過Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)一步分析和可視化，并建立相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。圖2顯示20個節(jié)點[TNF、IL-6、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、AKT1、TP53等]，64條邊，每個節(jié)點代表一個相關(guān)的蛋白，藥效作用更強(qiáng)的蛋白質(zhì)用較大的結(jié)點和較深的顏色描述。

圖2 杞菊地黃膠囊治療激光性視網(wǎng)膜損傷的PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 功能富集分析將交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行GO及KEGG分析，并通過MetaboAnalyst3.0對結(jié)果進(jìn)行可視化。GO富集分析結(jié)果顯示，杞菊地黃膠囊治療激光性視網(wǎng)膜損傷的靶點主要涉及癌癥的通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、人T細(xì)胞白血病病毒1型感染、HIF-1信號通路、鉑類耐藥性、利什曼病、NF-κB信號通路等(見圖3)。

圖3 杞菊地黃膠囊治療激光性視網(wǎng)膜損傷的GO富集分析

KEGG功能注釋富集分析結(jié)果顯示，135個作用靶點共富集到307條信號通路，選前20條信號通路進(jìn)行富集分析,圓形節(jié)點越大，富集基因數(shù)量越多，顏色越紅則富集越顯著。相關(guān)靶點主要富集于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路等(見圖4)。

圖4 杞菊地黃膠囊治療激光性視網(wǎng)膜損傷的KEGG富集分析

3 討論

激光光凝術(shù)在治療DR的同時，其光熱效應(yīng)也會對視網(wǎng)膜造成損傷。目前，西醫(yī)對此沒有針對性的治療和預(yù)防措施。中醫(yī)學(xué)將視網(wǎng)膜稱之為“視衣”，內(nèi)應(yīng)于腎，腎主水，故視網(wǎng)膜屬“五輪學(xué)說”之水輪；肝開竅于目，肝受血而能視，因此目中陰液源于肝腎。中醫(yī)認(rèn)為激光性熱毒所引起的改變屬火熱蘊結(jié)，灼傷肝腎中陰液，使目竅失養(yǎng)，視網(wǎng)膜由清澈透明轉(zhuǎn)為白色。DR多為老年患者，天癸竭，腎臟衰，故素體肝腎虧虛者居多，加之激光火毒之邪，最終導(dǎo)致“熱毒郁結(jié)，肝腎陰虛”病機(jī)的形成。

結(jié)合DR激光光凝術(shù)后的病因病機(jī)特點，我們選擇以滋補(bǔ)肝腎、清肝明目為治法。本法指用具有滋養(yǎng)肝腎陰液、清熱解毒明目的方藥治療眼科疾病。瞳神屬水輪，由腎所主，而“視衣”為瞳神的一部分，亦屬腎，肝腎精血相生，肝血為養(yǎng)目之源，腎精為司明之本，故從肝腎論治。因此，本研究選用具有滋補(bǔ)肝腎、清肝明目功效的杞菊地黃膠囊進(jìn)行治療。

杞菊地黃膠囊由杞菊地黃丸去蜂蜜而成，杞菊地黃丸出自《醫(yī)級寶鑒》，以六味地黃丸為基礎(chǔ)方加枸杞、菊花組成，具有滋補(bǔ)腎陰、清肝明目的功效。方中主藥熟地黃補(bǔ)血滋腎陰、填精，枸杞子滋補(bǔ)肝腎精血；輔以山藥益脾腎之陰而固精，山茱萸酸溫益肝腎精血；佐以茯苓淡滲脾濕，牡丹皮清肝瀉火、活血化瘀，澤瀉泄腎中濕濁，菊花清肝明目。諸藥合用，滋補(bǔ)與清泄兼顧，扶正與祛邪同治，共奏滋養(yǎng)肝腎、清肝明目之功效，臨床多用于治療肝腎陰虛所致的眩暈耳鳴，羞明畏光，迎風(fēng)流淚，視物昏花。研究發(fā)現(xiàn)，杞菊地黃丸可以“保護(hù)青光眼患者的視網(wǎng)膜”、“改善氣陰兩虛型DR患者的眼底病變”、“改善孔源性視網(wǎng)膜脫離復(fù)位術(shù)后患者術(shù)眼視網(wǎng)膜功能”，因此其廣泛應(yīng)用于治療青光眼、DR、視網(wǎng)膜脫離[8-10]。

雖然目前對杞菊地黃膠囊的藥理研究不多，但是杞菊地黃膠囊的基礎(chǔ)方六味地黃丸具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御功能，降低糖尿病患者的胰島素抵抗指數(shù)及增高胰島素敏感指數(shù)[11]，促進(jìn)眼部細(xì)胞新生、降低眼部毛細(xì)血管通透性的藥理特性。枸杞、熟地黃、山藥具有抗氧化的作用, 能夠加速對自由基的清除[12-13],對缺血、光毒作用、炎癥等引起的視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能的損害具有保護(hù)作用。山茱萸、牡丹皮、茯苓能夠抑制炎癥介質(zhì)相關(guān)蛋白基因的表達(dá)和炎癥因子的釋放,增加抗炎因子水平,發(fā)揮抗炎作用[14-16]。

激光所引起的視網(wǎng)膜損傷涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化損傷等多個方面。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，預(yù)測了杞菊地黃膠囊治療激光性視網(wǎng)膜損傷的作用機(jī)制，藥物活性成分與靶點分析結(jié)果顯示，酸漿苦素A、薯蕷皂苷配基等主要活性成分在激光性視網(wǎng)膜損傷治療中起著重要作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究指出，酸漿苦素A可以減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)[17]，薯蕷皂苷配基具有抗炎癥、抗氧化活性的藥理作用[18-19]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)，TNF、VEGFA、IL-6等可能是杞菊地黃膠囊治療激光性視網(wǎng)膜損傷過程中的關(guān)鍵靶點。激光性視網(wǎng)膜損傷最主要的表現(xiàn)是炎癥細(xì)胞浸潤和新生血管形成。研究發(fā)現(xiàn)，激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管中TNF、VEGF、IL過度表達(dá)[20-21]。其中TNF-α作為視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加的有效介質(zhì)，可以刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,導(dǎo)致VEGF表達(dá)升高，促進(jìn)新生血管形成。此外，本研究分析也發(fā)現(xiàn)，AKT1、TP53等基因與激光性視網(wǎng)膜損傷相關(guān)性也較密切，其作用有待更進(jìn)一步的研究加以明確。

GO富集分析結(jié)果提示，杞菊地黃膠囊可能通過抑制炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程發(fā)揮治療激光性視網(wǎng)膜損傷的作用。結(jié)合KEGG分析結(jié)果，杞菊地黃膠囊可能對AGE-RAGE信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路等多條信號通路具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，AGE-RAGE信號可激活NF-κB信號通路，NF-κB可促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子(如IL-6和TNF)以及與激光性視網(wǎng)膜損傷相關(guān)的基因VEGFA 的表達(dá)，從而加劇炎癥反應(yīng)[22]。HIF-1 信號通路在應(yīng)對機(jī)體缺氧過程中發(fā)揮著重要的作用，HIF-1α是HIF-1的一個亞單位，缺氧、血糖濃度升高等因素均可誘發(fā)其表達(dá)增多，HIF-1α可激活下游多種靶基因，共同發(fā)揮改善視網(wǎng)膜缺氧的作用[23]。杞菊地黃膠囊還可調(diào)節(jié)其他多條通路，在IL-17信號通路、癌癥的通路、胰島素抵抗等通路中均發(fā)揮著重要作用，符合中藥多成分、多靶點、多通路綜合治療疾病的特征。

綜上所述，杞菊地黃膠囊以滋補(bǔ)腎陰、清肝明目的功效在治療激光性視網(wǎng)膜損傷中發(fā)揮著重要的作用，杞菊地黃膠囊中的酸漿苦素A、薯蕷皂苷配基等有效成分，可能通過作用于TNF、IL-6、VEGFA 等靶點，調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號通路、NF-κB信號通路以及HIF-1信號通路，抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)，從而治療激光性視網(wǎng)膜損傷。