不同產(chǎn)地及種植年限巴戟天中6種寡糖類成分的定量分析

朱露林，沈 ，易曉薇，徐金龍，劉考鏵，劉夢(mèng)琴，張 奇，秦路平*，張巧艷*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六九醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051

巴戟天為茜草科（Rubiaceae）植物巴戟天Morinda officinalisHow.肉質(zhì)干燥根，主產(chǎn)于廣東、廣西、福建、海南等地，并收載于歷版《中國藥典》。巴戟天入肝、腎經(jīng)，味甘、辛，性溫；具有補(bǔ)肝腎、通筋活絡(luò)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功能，常用于治療陽痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、少腹冷痛、風(fēng)濕痹痛和筋骨痿軟等病癥[1-2]。研究表明巴戟天主要含有多糖、寡糖、環(huán)烯醚萜苷和蒽醌等化學(xué)成分，具有溫腎壯陽、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗骨質(zhì)疏松、抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等多種生物活性[3-7]。巴戟天含糖量較高，包括單糖、寡糖和多糖，《中國藥典》2020年版以寡糖類成分耐斯糖的含量作為評(píng)價(jià)巴戟天藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)寡糖類成分具有抗抑郁、抗焦慮、抗衰老、抗炎、促進(jìn)精子生成和抗心肌缺血再灌注等作用[2,8-11]。目前對(duì)寡糖類成分的測定，缺少以活性寡糖類成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)研究不同產(chǎn)地和生長年限的巴戟天藥材中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖含量變化情況。本研究以6種寡糖為指標(biāo)成分，采用HPLC-ELSD的方法進(jìn)行含量測定，對(duì)不同產(chǎn)地及種植年限巴戟天藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為巴戟天寡糖的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高校液相色譜儀（美國Agilent公司）；ELSD1290蒸發(fā)光散射檢測器（美國Agilent公司）。

蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖（蔗果四糖）、1F-果呋喃糖基耐斯糖（蔗果五糖）、蔗果六糖、蔗果七糖對(duì)照品均購于上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；乙腈為色譜純（泰坦科技股份有限公司），水為超純水，其余均為分析純。

21批巴戟天樣品于2017年4月至2019年10月采自福建、廣東和廣西等種植地，及2批商品藥材，編號(hào)S1～S23，見表1，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張巧艷教授鑒定為巴戟天Morinda officinalisHow.的地下部分。

表1 巴戟天藥材來源Table 1 Sources of Morinda officinalis

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖對(duì)照品適量，初始流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度分別為0.850、0.604、0.732、0.366、0.396、0.754 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取巴戟天粉末（過3號(hào)篩）約3 g，精密稱定，置具塞錐形中，精密加入5%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流30 min，放置室溫后，5%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，濾過。

2.3 色譜條件

色譜柱為Shodex Asahipak NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器為ELSD蒸發(fā)光散射檢測器，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B）,梯度洗脫：0～35 min，70%～67% A。體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量6 μL，漂移管溫度80 ℃，霧化管溫度40 ℃，平滑時(shí)間5.0 s，增益值為1.0，氮?dú)怏w積流量1.6 mL/min，柱溫28 ℃。6種寡糖對(duì)照品和樣品色譜圖見圖1，分離度均＞1.5。

圖1 巴戟天寡糖混合對(duì)照品 (A) 和供試品溶液 (B) 的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Morinda officinalis oligosaccharides mixed reference substances (A) and sample(B)

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）濾過，分別進(jìn)樣1、2、4、8、10、12、16、20、32 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，以質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 巴戟天6種寡糖類成分的線性關(guān)系Table 2 Linear relationships of oligosaccharides of Morinda officinalis

2.5 精密度試驗(yàn)

精密稱取樣品（S21），按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的峰面積RSD值分別為0.51%、0.06%、1.01%、0.28%、0.95%、0.09%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（S21）6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD值分別為2.94%、2.93%、1.59%、2.08%、1.16%、1.93%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品（S21），按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24、48 h測定。結(jié)果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的峰面積RSD值分別為1.48%、1.04%、0.89%、0.81%、0.70%、0.69%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測定樣品（S21）約0.02 g，共6份，分別精密加入蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖對(duì)照品適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，寡糖各成分的加樣回收率良好。蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的平均加樣回收率分別為99.22%、101.12%、98.71%、101.56%、100.37%、101.56%，RSD值分別為3.08%、0.85%、2.45%、2.56%、3.26%、3.11%。

2.9 樣品測定

精密稱取S1～S23批樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，取制備的供試品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，記錄峰面積，標(biāo)曲計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，福建栽培地區(qū)采收的樣品中，隨著種植年限的增加，寡糖的含量越來越低，寡糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在（232.53±9.48）～（342.31±43.88）mg/g，蔗果六糖以6年生南靖巴戟天含量最高，蔗果七糖以5年生龍巖巴戟天含量最高。廣東各栽培產(chǎn)地中寡糖含量在（111.92±6.52）～（394.68±19.14）mg/g，差異較大，其中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖的含量以3年生高要巴戟天含量最高。而野生巴戟天和商品藥材中寡糖各成分的含量均很低。

表3 巴戟天藥材中6種寡糖類成分的測定結(jié)果 (±s , n=3)Table 3 Determination results of six oligosaccharides in Morinda officinalis (±s , n=3)

表3 巴戟天藥材中6種寡糖類成分的測定結(jié)果 (±s , n=3)Table 3 Determination results of six oligosaccharides in Morinda officinalis (±s , n=3)

編號(hào) 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(μg·g-1)蔗糖 蔗果三糖 耐斯糖 蔗果五糖 蔗果六糖 蔗果七糖 總含量S1 32.99±0.88 20.57±1.31 49.03±2.38 63.30±3.41 59.38±3.36 80.87±4.36 306.13±12.97 S2 35.59±4.92 29.90±5.59 56.27±10.36 71.41±12.46 70.54±4.90 79.57±7.03 342.31±43.88 S3 29.30±8.22 15.03±3.04 42.13±9.35 58.21±12.21 56.82±11.29 79.89±10.33 281.36±53.91 S4 31.03±5.94 17.83±4.18 38.32±4.70 48.85±6.06 47.26±6.64 63.52±2.94 246.80±18.50 S5 32.93±1.26 15.04±0.44 36.61±0.37 49.63±1.00 47.83±1.02 64.10±2.05 246.15±4.51 S6 35.12±8.94 11.77±1.83 36.29±0.52 46.97±1.14 43.61±3.54 64.42±5.15 238.17±18.25 S7 20.71±4.88 10.75±1.09 38.02±1.41 50.85±2.57 48.32±3.49 63.87±4.45 232.53±9.48 S8 35.25±0.77 19.91±0.69 34.79±1.49 42.81±1.16 40.61±1.83 55.25±1.46 228.61±5.77 S9 63.74±2.26 37.01±1.91 67.95±3.57 80.72±4.42 69.82±3.40 75.44±4.15 394.68±19.14 S10 23.38±0.94 10.73±0.51 23.13±1.23 30.23±1.56 31.83±1.33 46.13±2.13 165.43±6.20 S11 34.93±1.21 15.61±0.78 39.76±2.23 51.61±2.93 48.47±2.74 62.04±3.68 252.42±12.27 S12 36.05±0.57 14.47±0.48 29.83±0.93 35.98±2.01 34.02±1.08 46.55±1.04 196.89±4.36 S13 23.96±0.38 23.76±0.67 34.45±1.00 43.90±0.95 43.37±0.56 58.57±1.55 228.01±4.77 S14 39.29±1.36 21.11±0.25 40.57±0.15 52.24±0.48 50.54±0.66 66.62±0.91 270.37±1.85 S15 13.74±1.47 13.35±0.82 27.52±1.42 35.67±1.12 35.27±0.79 47.40±1.71 172.96±4.66 S16 27.96±2.36 18.26±0.99 41.49±0.69 56.88±0.94 56.43±0.83 73.58±0.65 274.60±4.96 S17 27.75±1.43 20.04±0.52 34.94±0.54 45.30±0.27 45.67±0.89 61.18±2.12 234.89±2.67 S18 42.17±2.66 29.77±2.16 11.84±0.84 9.52±0.77 7.89±0.29 10.74±0.31 111.92±6.52 S19 30.53±0.52 14.61±0.43 33.99±1.24 45.31±2.45 44.49±1.44 62.62±3.86 231.56±8.73 S20 17.64±0.26 8.07±0.19 20.59±0.63 28.75±0.59 30.46±0.92 43.97±0.87 149.47±3.40 S21 15.06±0.92 9.81±0.83 20.55±0.67 26.84±0.80 27.03±0.37 38.41±1.11 137.69±3.63 S22 11.78±0.03 8.80±0.29 15.53±0.15 19.91±0.38 22.48±0.52 35.12±1.00 113.62±1.43 S23 12.30±0.25 6.17±0.07 16.84±0.58 23.81±0.92 24.52±0.45 38.01±0.92 121.65±2.43

3 討論

藥材中次生代謝產(chǎn)物的形成以及含量變化是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，與生態(tài)環(huán)境、生長年限以及物候期有著緊密的關(guān)系[12]。本研究通過采集不同產(chǎn)地及不同種植年限、采收時(shí)間的19批巴戟天新鮮樣品和2批野生巴戟天樣品及2批商品藥材進(jìn)行含量測定研究，發(fā)現(xiàn)巴戟天肉質(zhì)根中寡糖類成分的含量存在較大差異。

不同地區(qū)土壤、光照、降水、氣候等環(huán)境因素不同，影響寡糖類成分在肉質(zhì)根的積累過程，從而導(dǎo)致巴戟天藥材的質(zhì)量差異。巴戟天主產(chǎn)于福建、廣東、廣西等地，廣東種植基地較多，且分布較廣，這可能是導(dǎo)致寡糖類成分差異較大的原因；福建主要的種植基地漳州南靖和龍巖，種植規(guī)模均相對(duì)較小，屬于農(nóng)民散戶的小面積栽培。目前，廣西已無大面積巴戟天種植基地，多數(shù)為生長在深山環(huán)境中的野生品，自然環(huán)境中降水、光照和營養(yǎng)物質(zhì)等生長條件不穩(wěn)定，導(dǎo)致有效成分累積緩慢、含量偏低。除此之外，人工栽培巴戟天會(huì)于春季對(duì)枝葉進(jìn)行修剪以減少了水分的蒸騰及有機(jī)物的分解，使得植物長勢更好，有利于營養(yǎng)物質(zhì)更多的積累。這可能是2批野生巴戟天藥材寡糖含量較低的原因。

同一產(chǎn)地不同種植年限的巴戟天寡糖類成分含量之間也存在顯著的差異。福建巴戟天樣品結(jié)果顯示，隨著種植時(shí)間增長，寡糖增加呈先增后降的趨勢，廣東巴戟天寡糖含量也有此趨勢?？赡苁前完焐L期光合作用使得單糖合成并累積，并在酶的催化作用下合成寡糖，使其含量逐漸升高；隨著生長年限的增加，植物光合作用的速率下降，如氣孔和非氣孔限制（葉片衰老），使得單糖合成減少[13]。而耐斯糖等寡糖是在蔗糖的基礎(chǔ)上逐漸增加一個(gè)果糖而成[14]，可能是單糖逐漸與寡糖聚合，寡糖的上單糖的數(shù)量逐漸增加，最終聚合成多糖，這可能是導(dǎo)致后期巴戟天寡糖含量下降的原因。根據(jù)含量測定的結(jié)果提示，福建種植的巴戟天建議在6年左右采摘，廣東種植的巴戟天建議3年左右采摘為宜。

新鮮采摘的不同產(chǎn)地及種植年限的巴戟天樣品，除廣東莫村6年生巴戟天外，其余樣品耐斯糖的含量均高于2%，符合藥典規(guī)定的巴戟天中耐斯糖含量不低于2%[1]。6年生莫村巴戟天耐斯糖含量低于2%，可能是由于聚合度較低的寡糖如3～5糖慢慢水解，使得耐斯糖水解脫去1分子果糖成為蔗果三糖，蔗果三糖再脫去1分子果糖成為蔗糖，進(jìn)而導(dǎo)致蔗糖和果糖含量升高，耐斯糖的含量降低[15]。2批商品藥材中耐斯糖的含量低于2%，這可能是商品藥材在處理和儲(chǔ)存過程中也會(huì)導(dǎo)致寡糖含量的損失，與文獻(xiàn)[15]結(jié)果一致。

巴戟天抗抑郁的主要成分為耐斯糖，且藥典規(guī)定其耐斯糖含量不得低于2%[1]。此次研究通過測定不同產(chǎn)地、不同年限巴戟天中6種寡糖含量，闡明了不同產(chǎn)地巴戟天中寡糖含量差異及其最佳采收時(shí)間。巴戟天從種植到采收總體周期較長，而選擇在最佳采收時(shí)間采摘巴戟天可以更加充分地利用該資源，發(fā)揮更好的藥效，顯著提高巴戟天藥材的質(zhì)量，對(duì)巴戟天寡糖的質(zhì)量控制及其臨床應(yīng)用提供保障。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突