補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)及脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制

傅馨瑩，楊仁義，孫正驥，李艷玲，龍清吟，李俊熙，吳 露，張 偉*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

2.瀏陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽(yáng) 410300

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）與血管內(nèi)膜下的脂質(zhì)蓄積及局部血管炎性反應(yīng)密切相關(guān)，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）在血管內(nèi)膜下聚集，巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL形成的泡沫細(xì)胞不斷增多，釋放大量炎性因子，局部血管發(fā)生炎性反應(yīng)，促進(jìn)脂質(zhì)蓄積和細(xì)胞泡沫化，最終形成粥樣斑塊。AS病變過(guò)程中，脂質(zhì)蓄積常伴有炎性反應(yīng)的發(fā)生[1]?！秳?dòng)脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專(zhuān)家共識(shí)》[2]指出，抗AS的關(guān)鍵在于早期干預(yù)血脂異常、肥胖、高血壓等危險(xiǎn)因素，他汀類(lèi)藥物能夠顯著降低低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平并升高高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，具有穩(wěn)定或消退粥樣斑塊的作用，可以降低心腦血管疾病發(fā)生率。他汀類(lèi)藥物可以有效地調(diào)脂穩(wěn)斑，但其抑制血管炎性反應(yīng)作用較弱，目前臨床上尚無(wú)特異性針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)的有效藥物?！秳?dòng)脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專(zhuān)家共識(shí)》規(guī)范了中西醫(yī)診療方案，將AS分為痰瘀互結(jié)、氣陰兩虛、氣虛血瘀、氣滯血瘀4證，面色淡白而乏力身倦，伴有氣虛懶言，痛如針刺，舌暗或紫斑，脈沉而澀者，可予以補(bǔ)陽(yáng)還五湯治之[3]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠降低斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量，抑制泡沫細(xì)胞形成[4]；抑制斑塊中脂質(zhì)蓄積及炎性因子分泌，抑制炎性反應(yīng)，加速脂質(zhì)代謝[5]。

課題組前期研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分具有抑制炎性因子表達(dá)、減少炎性因子生成的作用[6-7]；補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分可以抑制血管內(nèi)膜增生，具有修復(fù)內(nèi)皮的作用，可能與調(diào)節(jié)血脂水平、改善局部微環(huán)境有關(guān)[8]，但補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分抗炎及調(diào)血脂的作用機(jī)制尚不明確。近年來(lái)，中西醫(yī)結(jié)合治療模式展現(xiàn)出協(xié)同增益效用，基于此推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分與阿托伐他汀在治療AS炎性反應(yīng)和脂質(zhì)代謝上具有協(xié)同作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分與阿托伐他汀治療AS的作用機(jī)制，從生物信息學(xué)角度挖掘出二者的潛在靶點(diǎn)及作用通路，并用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為中西醫(yī)結(jié)合抗AS奠定藥物基礎(chǔ)，為后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化研究提供新方向。

1 方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）；中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）；String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）；WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.webgestalt.org/#）；DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.7.2軟件。

1.1.2 藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分的主要成分黃芪甲苷、芍藥苷、苦杏仁苷及阿托伐他汀錄入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，收集其化學(xué)結(jié)構(gòu)式；將各化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得作用靶點(diǎn)，整合4個(gè)成分作用靶點(diǎn)并去除重復(fù)值，獲得藥物相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“atherosclerosis”“atherogenesis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM及TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)靶點(diǎn)信息，整合3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果并去除重復(fù)值，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.4 藥物-疾病靶點(diǎn)篩選 取交集，獲得藥物活性成分與AS的共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.1.5 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將所得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)入Cytoscape，使PPI網(wǎng)路可視化。利用cytoHubba插件對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取富集于前20的靶點(diǎn)，得到網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.6 藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 通過(guò)WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)，將共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，分別導(dǎo)出生物過(guò)程（biological process，BP)、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）富集分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行“加權(quán)集合覆蓋”分析；將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行KEGG通路富集分析，利用Cytoscape軟件對(duì)前20的通路與該通路涉及靶點(diǎn)構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，5～6周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（湘）2019-000。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，晝夜交替各12 h，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)LL2019102503）。

1.2.2 細(xì)胞 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞細(xì)胞庫(kù)。

1.2.3 藥材 補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、當(dāng)歸9 g、地龍9 g、紅花9 g、桃仁9 g組成，黃芪（批號(hào)190902）、赤芍（批號(hào)190701）、川芎（批號(hào)190902）、當(dāng)歸（批號(hào)190802）、地龍（批號(hào)191001）、紅花（批號(hào)190901）、桃仁（批號(hào)191101）購(gòu)自湖南新匯醫(yī)藥有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院左亞杰教授鑒定分別為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根、毛茛科植物川赤芍PaeoniaveitchiiLynch.的根、傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的根莖、傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels.的根尾、鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)的去內(nèi)臟全體、菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的花、薔薇科植物桃AmygdaluspersieaLinn.的干燥成熟種子，均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.2.4 藥品與試劑 阿托伐他汀片（批號(hào)H20133127，10 mg/片）購(gòu)自浙江樂(lè)普藥業(yè)股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)PM150210）、特級(jí)胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)164210-500）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；ox-LDL（批號(hào)YB-002）購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司；CCK8試劑盒（批號(hào)BS350B）購(gòu)自上海白鯊生物科技有限公司；油紅O染色液（批號(hào)G1262-4）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)分別為E-EL-M0049c、E-EL-M0044c）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；細(xì)胞總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）試劑盒（批號(hào)分別為E1015-50、E1016-50）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)70-PQ0012）購(gòu)自上海碧云天天生物科技有限公司；ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)GE2301-100）購(gòu)自美國(guó)Genview公司；Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase-2，JAK2）抗體、磷酸化JAK2（p-JAK2）抗體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體、p-STAT3抗體（批號(hào)分別為ab108596、ab32101、ab68153、ab76315）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)分別為02536-1-AP、SA00001-2）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒（批號(hào)DP419）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒（批號(hào)E047、E096）購(gòu)自上海近岸科技有限公司；JAK2、STAT3、β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.5 儀器 CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；Cytation 3型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；Heraeus Fresco 17型超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；T100 Thermal Cycler qRT-PCR儀、Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽、Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2.6 補(bǔ)陽(yáng)還五湯的制備 補(bǔ)陽(yáng)還五湯浸膏由湖南中藥研究所制備，取原方藥材，浸泡30 min后，加入12倍量水煎煮2 h，濾過(guò)；再加入10倍量水煎煮1.5 h，濾過(guò)；合并2次濾液，濃縮至100 mL，減壓干燥濃縮為干膏（21.32 g/付），不加輔料打磨成粉，密封備用。補(bǔ)陽(yáng)還五湯浸膏稀釋后，經(jīng)大孔樹(shù)脂色譜、高效液相色譜等方法提取苷類(lèi)組分浸膏（1.286 6 g/付）[9]。原方提取物和苷類(lèi)組分提取物以高效液相色譜法進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，苷類(lèi)組分中的黃芪甲苷、苦杏仁苷、芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為37.98、5.48、103.6 mg/g[10]。

1.2.7 含藥血清的制備 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯（10.8 g/kg）組、苷類(lèi)組分（0.64 g/kg）組和阿托伐他?。?.9 mg/kg）組，每組5只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，2次/d，連續(xù)7次。于末次給藥2 h后，大鼠ip 10%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取血后脫頸椎處死。全血3000 r/min離心15 min，取上層血清，分別得到空白血清、補(bǔ)陽(yáng)還五湯血清、苷類(lèi)組分血清及阿托伐他汀血清，于恒溫水浴鍋56 ℃滅活30 min，濾過(guò)分裝，于-80 ℃保存。

1.2.8 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×105/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁。設(shè)置對(duì)照組和ox-LDL（25、50、75、100、125 μg/mL）組，各給藥組加入相應(yīng)溶液，對(duì)照組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、3、6、12、24、48 h，加入CCK8試劑，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對(duì)照－A空白)

1.2.9 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化的影響 在確定對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無(wú)影響的ox-LDL質(zhì)量濃度范圍（0～100 μg/mL）及刺激時(shí)間（0～24 h）后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以2.5×105/孔接種于放有細(xì)胞爬片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁。加入ox-LDL（50 μg/mL），分別培養(yǎng)0、3、6、12、24 h，以確定ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化的合適時(shí)間；加入含不同質(zhì)量濃度ox-LDL（0、25、50、75、100 μg/mL）的10% FBS DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，以確定ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化的合適質(zhì)量濃度。取出細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，甘油封片。染色后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯紅色脂質(zhì)顆粒。

1.2.10 CCK8法確定含藥血清作用于RAW264.7細(xì)胞的濃度和時(shí)間 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁。設(shè)置對(duì)照組和空白血清（1%、5%、10%、15%、20%）組，空白血清組加入含不同濃度空白血清的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入CCK8試劑，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的A值，計(jì)算空白血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，獲得無(wú)細(xì)胞毒性的含藥血清濃度。

細(xì)胞抑制率＝(A對(duì)照－A給藥)/(A對(duì)照－A空白)

1.2.11 細(xì)胞分組及干預(yù) 在確定造模條件后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁。設(shè)置對(duì)照組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯（10%）組和苷類(lèi)組分高、中、低劑量（10.0%、5.0%、2.5%）組及阿托伐他汀（10%）組。對(duì)照組和模型組加入10%空白血清，苷類(lèi)組分高劑量組加入10%苷類(lèi)組分血清，苷類(lèi)組分中劑量組加入5%苷類(lèi)組分血清和5%空白血清，苷類(lèi)組分低劑量組加入2.5%苷類(lèi)組分血清和7.5%空白血清，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和阿托伐他汀組分別加入10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯血清及10%阿托伐他汀血清，預(yù)處理3 h；再加入含ox-LDL（75 μg/mL）的含藥或空白血清的DMEM培養(yǎng)基干預(yù)24 h。

1.2.12 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響 按“1.2.11”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入裂解液反應(yīng)10 min，離心取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)TC及FC含量，膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）為T(mén)C與FC的差值，CE/TC＞50%為泡沫細(xì)胞模型的標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.2.13 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化程度的影響 按“1.2.11”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，進(jìn)行油紅O染色，于顯微鏡下隨機(jī)觀察6個(gè)不重合的視野，取細(xì)胞內(nèi)含有5個(gè)以上較大紅色染料顆粒作為泡沫細(xì)胞形成的標(biāo)準(zhǔn)[12]，計(jì)數(shù)泡沫化細(xì)胞并計(jì)算泡沫細(xì)胞陽(yáng)性率。

泡沫細(xì)胞陽(yáng)性率=泡沫細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)

1.2.14 ELISA檢測(cè)含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響 按“1.2.11”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，吸取上清，離心，收集上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平。

1.2.15 Western blotting檢測(cè)含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 按“1.2.11”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，收集各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉90 min，分別加入β-actin（1∶6000）、JAK2（1∶2000）、p-JAK2（1∶2000）、STAT3（1∶2000）和p-STAT3（1∶2000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶6000），37 ℃孵育60 min；采用ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，并用Image Lab 4.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.16 qRT-PCR檢測(cè)含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞JAK2和STAT3mRNA表達(dá)的影響 按“1.2.11”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：JAK2上游引物5’-CGCTCAGACAGTATCATCT-3’，下游引物5’-CTCCAACTTCTCTTCTTACAC-3’；STAT3上游引物5’-AGGACATCAGTGGCAAGA-3’，下游引物5’-AGGTAGACAAGTGGAGACA-3’；β-actin上游引物5’-TTCCAGCCTTCCTTCTTG-3’，下游引物5’-GGAGCCAGAGCAGTAATC-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較若符合正態(tài)性且方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析LSD法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)，采用Tamhane’sT2法進(jìn)行兩兩比較；若不符合正態(tài)性時(shí)，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 藥物抗AS靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲得藥物主要成分相關(guān)作用靶點(diǎn)163個(gè)，其中黃芪甲苷26個(gè)、芍藥苷24個(gè)、苦杏仁苷38個(gè)、阿托伐他汀100個(gè)。通過(guò)GeneCards、OMIM及TCMIP得到疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)1165個(gè)。通過(guò)Bioinformatics Gent數(shù)據(jù)庫(kù)取交集，獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)65個(gè)，韋恩圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件，獲得有63個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。用CytoHubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到富集于?0靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。度值、緊密度、介數(shù)從高到低的前5位為相同靶點(diǎn)，依次為T(mén)NF、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）、STAT3、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3），表明這些靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中影響能力大，受其他靶點(diǎn)的影響小，在治療AS中發(fā)揮重要的作用。

圖2 “藥物-疾病”靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of “drug-disease” targets

圖3 度值 (A)、緊密度 (B) 和介數(shù) (C) 拓?fù)浞治鰣DFig.3 Topology analysis diagram of degree (A), closeness (B) and betweenness (C)

2.1.3 GO和KEGG通路富集分析 通過(guò)WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GO富集分析結(jié)果，其中BP分析結(jié)果260個(gè)、CC分析結(jié)果2個(gè)、MF分析結(jié)果17個(gè)。GO富集分析顯示，共同靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)、膜區(qū)，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、內(nèi)肽酶、磷脂酰肌醇激酶等活性以及與磷酸酶、糖胺聚糖、脂多糖、細(xì)胞因子受體等結(jié)合的方式，參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、肌細(xì)胞增殖、脂質(zhì)定位、傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)等生物過(guò)程。通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得KEGG通路富集分析結(jié)果，共富集78條通路，“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4，藥物主要通過(guò)參與HIF-1、JAK/STAT、Rap1、VEGF等信號(hào)通路治療AS。

圖4 “靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.4 “Target-pathway” network

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，為進(jìn)一步探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分與阿托伐他汀在治療AS的作用，本研究基于JAK2/STAT3信號(hào)通路，以炎性反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常為切入點(diǎn)，在RAW264.7細(xì)胞泡沫化模型中研究聯(lián)合用藥對(duì)脂質(zhì)含量、泡沫化程度及炎性因子的影響，為中西醫(yī)結(jié)合治療AS的協(xié)同增益效用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.2.1 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 如表1所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL（125 μg/mL）作用于RAW264.7細(xì)胞3、6、12、48 h均顯著降低細(xì)胞活力（P＜0.05、0.01），抑制細(xì)胞增殖；ox-LDL（50、75、100 μg/mL）作用于RAW264.7細(xì)胞48 h顯著降低細(xì)胞活力（P＜0.05、0.01）。ox-LDL（0～100 μg/mL）作用于RAW264.7細(xì)胞0～24 h，細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。

表1 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 (±s , n=6)Table 1 Effect of ox-LDL on viability of RAW264.7 cells (±s , n=6)

表1 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 (±s , n=6)Table 1 Effect of ox-LDL on viability of RAW264.7 cells (±s , n=6)

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs control group

組別 劑量/(μg·mL-1) 細(xì)胞存活率/%0 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照 — 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ox-LDL 25 100.00 98.29±8.65 99.51±12.05 114.26±12.14# 105.22±6.45 105.76±5.79 50 100.00 101.03±9.54 99.22±7.23 95.65±10.62 105.31±7.46 91.40±2.12#75 100.00 96.91±5.36 95.16±6.55 94.85±7.04 101.63±5.87 70.59±5.99##100 100.00 92.86±10.61 94.70±10.88 93.51±6.00 100.24±3.94 58.96±2.32##125 100.00 91.66±7.54# 93.75±3.32# 83.68±6.31## 94.45±3.86 28.70±10.75##

2.2.2 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化的影響 細(xì)胞吞噬ox-LDL后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量積聚形成泡沫細(xì)胞，為了確定ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞泡沫化的最佳時(shí)間和最佳質(zhì)量濃度，通過(guò)油紅O染色檢測(cè)ox-LDL干預(yù)后RAW264.7細(xì)胞泡沫化程度。如圖5所示，與對(duì)照組相比，ox-LDL（50 μg/mL）作用于細(xì)胞后，胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增多，泡沫化程度逐漸增加，呈時(shí)間相關(guān)性。如圖6所示，隨著ox-LDL質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞泡沫化程度逐漸增強(qiáng)；當(dāng)ox-LDL質(zhì)量濃度為75 μg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有大量脂質(zhì)存在，細(xì)胞體積增大，多呈圓形，泡沫化程度較高，其后泡沫化程度未見(jiàn)明顯增高。由此確定以ox-LDL（75 μg/mL）刺激RAW264.7細(xì)胞24 h為造模條件。

圖5 ox-LDL (50 μg/mL) 對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化的影響 (×200)Fig.5 Effect of ox-LDL (50 μg/mL) on foaming of RAW264.7 cells (× 200)

圖6 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化的影響 (×200)Fig.6 Effect of ox-LDL on foaming of RAW264.7 cells (× 200)

2.2.3 空白血清的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 如圖7所示，與對(duì)照組比較，血清濃度為1%、5%、15%、20%時(shí)，對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制作用（P＜0.05、0.01）。因此，選取10%血清濃度為無(wú)細(xì)胞毒性的血清濃度。

2.2.4 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響 如圖8所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE含量和CE/TC值明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯、苷類(lèi)組分高、低劑量組以及阿托伐他汀組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE含量顯著降低（P＜0.01），苷類(lèi)組分中劑量組細(xì)胞內(nèi)TC、CE含量顯著降低（P＜0.01），苷類(lèi)組分高、中劑量組以及阿托伐他汀組細(xì)胞內(nèi)CE/TC值顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖 7 空白血清對(duì) RAW264.7細(xì)胞抑制率的影響(±s , n=6)Fig.7 Effect of blank serum on inhibition rate of RAW264.7 cells (±s , n=6)

圖8 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE含量及CE/TC的影響 (±s , n=6)Fig.8 Effect of blank serum on contents of TC, FC, CE and CE/TC in RAW264.7 cells (±s , n=6)

2.2.5 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞泡沫化程度的影響 如圖9和表2所示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)多呈梭形，細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯脂質(zhì)聚集，泡沫化細(xì)胞少。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞多呈圓形，體積有明顯的增大，胞內(nèi)大量脂質(zhì)積聚，泡沫化細(xì)胞顯著增多（P＜0.01）。與模型組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、苷類(lèi)組分中劑量組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚減少，泡沫化細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）；阿托伐他汀組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚顯著減少，泡沫化細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）；苷類(lèi)組分高、低劑量組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚減少。

表2 油紅O染色泡沫化細(xì)胞相對(duì)含量Table 2 Relative content of foamed cells stained with oil red O

圖9 含藥血清對(duì)ox-LDL干預(yù)的RAW264.7細(xì)胞泡沫化的影響 (×400)Fig.9 Effect of drug-containing serum on foaming of RAW264.7 cells intervened by ox-LDL (× 400)

2.2.6 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎性因子分泌的影響 如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組上清液中TNF-α和IL-6水平顯著降低（P＜0.01）。

圖10 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響 (±s , n=6)Fig.10 Effect of drug-containing serum on levels of TNF-α and IL-6 in supernatant of RAW264.7 cells (±s , n=6)

2.2.7 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 如圖11所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。

圖11 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 (±s , n=5)Fig.11 Effect of drug-containing serum on expressions of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 in RAW264.7 cells(±s , n=5)

2.2.8 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞JAK2和STAT3mRNA表達(dá)的影響 如圖12所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞JAK2和STAT3mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞JAK2和STAT3mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。

圖12 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)的影響 (±s , n=5)Fig.12 Effect of drug-containing serum on mRNA expressions of JAK2 and STAT3 in RAW264.7 cells(±s , n=5)

3 討論

AS是導(dǎo)致腦梗死、心肌梗死、冠心病等多種心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，腦動(dòng)脈、主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈及外周動(dòng)脈的血管病變是AS的始動(dòng)因素，主要特征是泡沫細(xì)胞的形成、脂質(zhì)蓄積和局部血管炎性反應(yīng)的發(fā)生。補(bǔ)陽(yáng)還五湯及苷類(lèi)組分（苦杏仁苷、芍藥苷、黃芪甲苷）具有抗腦缺血、抗血管內(nèi)膜增生、抗血管平滑肌增殖等作用[8,10,13-15]；Liu等[3]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)多組分激活NF-κB通路，抑制IL-6和TNF-α表達(dá)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善血管內(nèi)膜，從而發(fā)揮抗AS作用。因此，補(bǔ)陽(yáng)還五湯或其有效組分與阿托伐他汀聯(lián)用可能具有較好的抗AS作用，其作用機(jī)制可能與抗炎、調(diào)脂穩(wěn)斑的雙重作用有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)有效組分能夠抑制增生內(nèi)膜中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成，上調(diào)增生血管內(nèi)膜I型膠原（collagen-I，Col-I）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，發(fā)揮抗AS血管內(nèi)膜增生的作用?；诖?，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯主要苷類(lèi)有效組分與阿托伐他汀治療AS的潛在作用機(jī)制，結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)主要組分與阿托伐他汀能夠調(diào)控AKT1、VEGFA、STAT3、CASP3等65個(gè)靶點(diǎn)，介導(dǎo)JAK/STAT、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、TNF等78條信號(hào)通路，在ECM或膜區(qū)，參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、肌細(xì)胞增殖、脂質(zhì)定位等17個(gè)生物過(guò)程，從而治療AS。本研究從生物信息學(xué)角度初步證實(shí)了補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)有效組分與阿托伐他汀能夠通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同抗AS，其作用機(jī)制可能與調(diào)控JAK/STAT通路、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及脂質(zhì)代謝異常有關(guān)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了理論基礎(chǔ)和研究方向。

本研究進(jìn)一步采用ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞泡沫化，從細(xì)胞活力、細(xì)胞泡沫化等方面，選取10%血清濃度為無(wú)細(xì)胞毒性的血清濃度，以75 μg/mL ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞24 h為最佳模型，與Cao等[16]用ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建的AS模型一致。結(jié)果顯示，各給藥組均能夠減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，降低泡沫化細(xì)胞數(shù)量，抑制RAW264.7細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，顯著減少細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE含量，補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分中劑量組與阿托伐他汀組療效相當(dāng)，提示在調(diào)節(jié)脂質(zhì)方面，中劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分與阿托伐他汀聯(lián)合用藥，可以協(xié)同發(fā)揮調(diào)脂穩(wěn)斑的作用。各給藥組均能夠抑制TNF-α和IL-6分泌，補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗炎作用最佳，其次為中劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)組分，提示在抗炎方面，苷類(lèi)組分可能為補(bǔ)陽(yáng)還五湯的主要藥效物質(zhì)，可以作為補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方的精準(zhǔn)有效組分替代藥物發(fā)揮抗炎作用。各給藥組均能夠抑制JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)水平，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其苷類(lèi)有效組分能夠通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，在AS進(jìn)程中發(fā)揮抗炎和調(diào)節(jié)脂質(zhì)的作用。

綜上所述，取10%血清濃度為無(wú)細(xì)胞毒性的血清濃度，以75 μg/mL ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞24 h能較好地模擬AS疾病模型；補(bǔ)陽(yáng)還五湯苷類(lèi)有效組分與阿托伐他汀能夠通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同抗AS，其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及TC、FC、CE含量，抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌有關(guān)；適宜劑量的苷類(lèi)組分調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面與阿托伐他汀相當(dāng)，且抗炎作用優(yōu)于阿托伐他汀，提示苷類(lèi)組分有望成為抗AS的有效藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突