SOD強化奶片的抗氧化性及對人體經(jīng)絡電壓的作用

嚴蘇晴，俞曉衛(wèi)，郭靜科，許明明，陳盧杭，王 強，柯李晶，饒平凡*

氧是一切生命活動的基礎物質之一，地球上所有動、植物以及需氧生物的生命活動都離不開氧。然而，在機體代謝的過程中，5%的氧會變成性質活潑的氧自由基。氧自由基具有極強的氧化性，過多的氧自由基會導致人體過早衰老和引發(fā)多種疾病，包括癌癥、心血管疾病、糖尿病等[1]，被視為人體的垃圾，百病之源[2]。SOD 是機體內天然存在的超氧自由基清除因子，能夠消除生物體內過量活性氧所引起的氧化應激作用，從而提高人體免疫力，防御疾病，清除疲勞和延緩衰老[3]。

奶類食品在人們的日常膳食中占有一定的比重，可滿足人體對鈣的需求，屬于膳食平衡寶塔中的第4 層。然而，局限于乳制品不能完全滿足各類人群的生理代謝及營養(yǎng)需求的現(xiàn)狀，很多國家開始對奶類食品進行必要的營養(yǎng)調整，以適應某些特定人群的營養(yǎng)需要[4]。市面上逐漸出現(xiàn)SOD 強化的奶制品[2]。研究表明SOD 具有良好的穩(wěn)定性[5]，將SOD 添加到奶粉中制成的SOD 強化奶粉，可明顯延長果蠅的壽命，對小鼠也有免疫調節(jié)作用[6]。

對食品的功能性研究中，人體經(jīng)絡電壓可以作為一種參考指標。研究發(fā)現(xiàn)，人體經(jīng)絡電壓可用于評價草本飲料[7]和茶[8-9]的生理功效，還可以評價藥食同源功能性食品，如樺褐孔菌[10]、蛹蟲草[11]和鐵皮石斛[12]等，甚至可以用于觀察吸煙[13]、穴位抗氧化干預[14]對生理產(chǎn)生的實時作用以及對高血壓患者血壓的監(jiān)測[15]。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 奶片與SOD 強化奶片的來源 奶粉，品牌：Nouriz/紐瑞滋；規(guī)格：1 kg/袋；產(chǎn)地：新西蘭。

SOD，酶活為2.53×106U/g 組織濕重，由福州大學生物工程研究所提供[16]。

奶片，每片由1 g 奶粉壓片制得；SOD 強化奶片，每片由SOD 酶粉與奶粉按1∶100 的質量比混合后取1 g 壓片制得。

1.1.2 生化檢測樣品的制備 將奶片或SOD 強化奶片加入溫開水中，質量體積比為1∶8，進一步稀釋10 倍，得到質量濃度為12.5 mg/mL 的溶液。用離心機在25 ℃，1.196×105r/min 下離心10 min，取上清液，隨后用于抗氧化指標的測定。

1.1.3 主要試劑與儀器 總超氧化物歧化酶（TSOD）測試盒，南京建成；氧化還原電位儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CF15RXⅡ高速離心機，日本HITACHI 公司；UV-1700 紫外分光光度計，日本津島公司；Ag/AgCl 一次性使用心電電極片，上海鈞康醫(yī)用設備有限公司；RM6240C多通道生理信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 氧化-還原電位測定 分別量取100 mL 的樣品溶液用于測定氧化-還原電位。在測定前，需先用醌氫醌標準飽和溶液對鉑電極進行標定，然后用ORP 電極平行測定3 次，取平均值。

1.2.2 DPPH 自由基清除能力測定 取2 mL 不同質量濃度（1.250，1.562，3.125 mg/mL） 奶片或SOD 強化奶片的樣品溶液，隨后加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液。將其充分混勻后，置于室溫下避光反應，時間為30 min，反應結束時在波長517 nm 的條件下測定吸光值，記作Ai。其中，空白對照組為樣品液加無水乙醇各2 mL，測定517 nm 處吸光值，記作Aj；對照組為DPPH 溶液加無水乙醇各2 mL，測定517 nm 處吸光值，記作A0。每個樣品平行測定3 次并計算平均值。

樣品對DPPH 自由基的抑制率計算公式：

抑制率=［1－（Ai－Aj）/A0］×100%

1.2.3 SOD 活力測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活力[17]。依照SOD 試劑盒操作說明書的順序依次加樣。最后使用紫外分光光度計，設定測定波長為550 nm，測定各管的OD 值。計算公式為：

式中：50%為抑制率。

1.2.4 臨床試驗

1.2.4.1 試驗對象 2018年9月至2019年3月在營養(yǎng)中心征集符合納入標準的志愿者20 例。納入標準：（1）年齡>18 歲；（2）簽署知情同意書，自愿參加試驗者；（3）充分了解研究方案，并且能夠積極配合試驗者；（4）對奶制品無過敏反應者；（5）無腎、肝、心血管等嚴重器質性疾病。排除標準：（1）年齡≤18 歲；（2）存在長期服用藥物的情況。此研究經(jīng)過中國科學院上海生命科學研究院-浙江工商大學食品營養(yǎng)科學聯(lián)合研究中心倫理委員會批準（31500685-4）。

1.2.4.2 試驗分組 將志愿者按雙盲法的分組標準隨機分為2 組，每組10 人。其中，對照組含服奶片，試驗組含服SOD 強化奶片。

1.2.4.3 試驗方案及流程 穴位電壓的測定統(tǒng)一安排在上午9：00 至11：00 時間段內完成，并確保志愿者在試驗前半小時內無進食。試驗開始前先詢問志愿者近期內的健康狀況并做記錄。隨后安排試驗對象平躺在床上并保持身心放松。

以12 條經(jīng)絡上的合穴（正極）與原穴（負極）作為經(jīng)絡電壓的測量點（表1）[16]。先對穴位測量點附近的毛發(fā)進行適當修剪，隨后用醫(yī)用酒精擦拭相應皮膚，待酒精揮發(fā)完全后按照標準[18]找到對應的穴位。依次將Ag/AgCl 一次性心電電極貼粘貼于各個穴位處，接著連接到電極和生理信號采集處理系統(tǒng)上，正式開始采集數(shù)據(jù)并記錄。

表1 經(jīng)絡電壓的測量點Table 1 The selected acupuncture points

試驗開始后，預先平衡25 min，觀察到受試者的穴位間電位穩(wěn)定（5 min 內電壓波動小于10 mV） 后，讓受試者含服1 片奶片或SOD 強化奶片，并進行60 min 的穴位間電壓監(jiān)測。

1.2.4.4 數(shù)據(jù)處理方法 利用SPSS for windows 13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，其中，測定的樣本結果以平均值±標準差（±s）表示。兩獨立樣本均數(shù)比較用t 檢驗，P<0.05 表示結果有顯著性差異，P<0.01 表示結果有高度顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 奶片與SOD 強化奶片的抗氧化活性檢測結果

奶片與SOD 強化奶片制備液的氧化還原電位、SOD 活力的測定結果如表2所示。從氧化還原電位的測定結果中可以看出，奶片和SOD 強化奶片的電位值分別為（212.66±6.96）mV、（200.53±1.23）mV，SOD 強化奶片的氧化還原電位值略低于奶片；從SOD 活力的測定結果看，SOD 強化奶片的酶活力為28 299.30 U/g，約為奶片酶活力的65 倍。

表2 奶片與SOD 強化奶片的氧化還原電位、SOD 活力分析Table 2 The analysis of oxidation-reduction potential and SOD scavenging activity

由表3可知，不同濃度的奶片和SOD 強化奶片樣品表現(xiàn)出的DPPH 自由基的抑制能力各不相同。在奶片組中可以發(fā)現(xiàn)，樣品濃度越高，抑制DPPH 自由基的能力越強。但在SOD 強化奶片組中，隨著樣品濃度的增加，對DPPH 自由基抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在質量濃度為1.250與1.562 mg/mL 時SOD 強化奶片組的DPPH 自由基抑制率高于同濃度的奶片組；在質量濃度為3.125 mg/mL 時，奶片組的DPPH 自由基抑制率卻高于SOD 強化奶片組。

表3 奶片與SOD 強化奶片抑制DPPH 自由基能力（±s，n=3，%）Table 3 DPPH free radical scavenging capacity of milk tablet and SOD enriched milk tablet（ ±s，n=3，%）

表3 奶片與SOD 強化奶片抑制DPPH 自由基能力（±s，n=3，%）Table 3 DPPH free radical scavenging capacity of milk tablet and SOD enriched milk tablet（ ±s，n=3，%）

?項目 質量濃度/mg·mL-1 1.250 1.562 3.125奶片 2.81±0.02 9.36±0.24 16.92±0.35 SOD 強化奶片 10.82±0.29 12.05±0.36 8.60±0.14

2.2 奶片及SOD 強化奶片對12 條經(jīng)絡電壓的影響

2.2.1 SOD 強化奶片單獨作用的經(jīng)絡 由圖1所示，志愿者含服SOD 強化奶片后，其肺經(jīng)和膽經(jīng)的電壓值在50 min 左右開始明顯升高（上升幅度達到15 mV 以上），并始終維持在較高水平。而含服奶片志愿者的肺經(jīng)和膽經(jīng)的電壓無明顯波動。

圖1 奶片及SOD 強化奶片對人體肺經(jīng)（a）、膽經(jīng)（b）經(jīng)絡電壓的影響Fig.1 The effects on electric potential difference of Lung（d） and Gallbladder（a） Meridian by milk tablet and SOD enriched milk tablet

2.2.2 SOD 強化奶片作用更強的經(jīng)絡 由圖2所示，志愿者含服奶片或SOD 強化奶片后，大腸經(jīng)、脾經(jīng)、小腸經(jīng)、膀胱經(jīng)、三焦經(jīng)和肝經(jīng)的經(jīng)絡體表電壓均表現(xiàn)出較強的波動性。其中，脾經(jīng)、小腸經(jīng)和膀胱經(jīng)在25 min 進行干預后電壓值就發(fā)生迅速響應。表現(xiàn)為干預后10 min 左右就出現(xiàn)5～20 mV 的電壓波動（包括上升和下降），以奶片組的膀胱經(jīng)變化最為顯著，在10 min 內由30.34 mV 驟降至14.06 mV，并且隨后出現(xiàn)多個波峰。大腸經(jīng)、三焦經(jīng)和肝經(jīng)的電壓值則在干預后的55 min 后才出現(xiàn)明顯變化?？傮w來看，含服奶片組的經(jīng)絡電壓響應時間比SOD 強化奶片組都要短。

圖2 奶片及SOD 強化奶片對人體大腸經(jīng)（a）、脾經(jīng)（b）、小腸經(jīng)（c）、膀胱經(jīng)（d）、三焦經(jīng)（e）和肝經(jīng)（f）經(jīng)絡電壓的影響Fig.2 The effects on electric potential difference of Large Intestine（a），Spleen（b），Small Intestine（c），Bladder（d），Triple Energizer（e） and Liver（f） Meridian by milk tablet and SOD enriched milk tablet

2.2.3 奶片和SOD 強化奶片共同作用的經(jīng)絡由圖3所示，奶片組和SOD 強化奶片組在25 min時進行干預，兩組的胃經(jīng)、心經(jīng)、腎經(jīng)和心包經(jīng)在電壓變化及趨勢上都較為相似。其中，心經(jīng)和心包經(jīng)的電壓值在受到干預后迅速波動并出現(xiàn)多個波峰。胃經(jīng)和腎經(jīng)的電壓值在干預后的40 min 左右開始出現(xiàn)明顯波動。

圖3 奶片及SOD 強化奶片對人體胃經(jīng)（a）、心經(jīng)（b）、腎經(jīng)（c）和心包經(jīng)（d）經(jīng)絡電壓的影響Fig.3 The effects on electric potential difference of Stomach（a），Heart（b），Kidney（c） and Pericardium（d）Meridian by milk tablet and SOD enriched milk tablet

3 討論

本研究選取左側12 條經(jīng)絡的原穴與合穴作為測定經(jīng)絡電壓變化的測量點。相對于其它穴位，左側經(jīng)脈的原穴和合穴的電位差的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性最佳，可以用作經(jīng)絡電壓的檢測位點[16]。

經(jīng)測定，本試驗所用的SOD 酶粉活力在添加至奶片中的前后基本保持一致，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。且從氧化還原電位的測定結果看，SOD 強化奶片表現(xiàn)出一定的還原性。從DPPH 自由基抑制率的試驗結果中可以發(fā)現(xiàn)，奶片組對DPPH 自由基的抑制率隨著濃度的上升而增加，但在SOD 強化奶片組中卻無類似規(guī)律，隨著濃度的上升，樣品的抑制率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。且SOD 強化奶片組在質量濃度為1.250 與1.562 mg/mL 時，對DPPH 自由基的抑制率均高于同濃度的奶片組，但在質量濃度為3.125 mg/mL 時，SOD 強化奶片組卻低于奶片組。造成這種現(xiàn)象的原因可能是在較低的樣品濃度下，SOD 的加入使得樣品溶液中產(chǎn)生了某種類似于DPPH 自由基的氧化物，使測得的抑制率下降。但總體而言，SOD 強化奶粉具有一定清除DPPH 自由基的能力，這對經(jīng)SOD 強化的奶制品的最適沖泡濃度具有一定的指導意義。

口腔含片是一種在口腔內緩慢溶解的壓制片，其主要吸收部位在舌下和口腔頰面黏膜?？谇晃蛰^胃腸道吸收更快速，更易發(fā)揮功能物質的作用。在經(jīng)絡體表電位的監(jiān)測試驗中，志愿者表示在5 min 左右口腔中的含片基本消失。此時，從經(jīng)絡電壓的記錄結果可以看到，受試者在開始服用含片后的10 min 內小腸經(jīng)、膀胱經(jīng)、脾經(jīng)、心經(jīng)和心包經(jīng)發(fā)生了迅速響應，且SOD 強化奶片組的電壓值波動大于奶片組，這可能是添加的SOD 快速透過了口腔黏膜，通過清除機體代謝產(chǎn)生的超氧陰離子自由基引起了相應穴位的體表電位變化。而對于含服奶片同樣有作用的胃經(jīng)、心經(jīng)、腎經(jīng)和心包經(jīng)來說，可能是因為奶片中含有的微量SOD或其它活性物質起了作用。研究發(fā)現(xiàn)MS-SOD 能夠改善小鼠組織抗氧化能力和氧化應激水平，緩解其腸黏膜損傷[19]；SOD-TAT 對受輻射小鼠肺損傷有保護作用，可有效增強肺的抗氧化能力，減少了輻射誘導的肺纖維化，提高了輻照小鼠的生活質量[20]。GST-TAT-SOD 能明顯增強脾臟抗氧化活性，完全阻止了受輻照小鼠脾臟的損傷[21]；合成的含鎳超氧化物歧化酶可減少活性氧的產(chǎn)生，減輕對苯二胺誘導的大鼠膀胱炎癥及排尿功能障礙[22]；強化SOD 刺梨汁可明顯降低砷中毒動物肝中的砷含量，對肝組織具有保護作用[23]；SOD 可明顯增加心臟的血流，增強心臟亞細胞結構和收縮功能以及定性形態(tài)，改善心臟及心包功能[24]。12 條經(jīng)絡中的腎經(jīng)、胃經(jīng)、三焦經(jīng)、大腸經(jīng)、肺經(jīng)、肝經(jīng)和膽經(jīng)的電壓值在干預后的55 min 才出現(xiàn)一定的波動，可能是不同部位對SOD 的吸收速度不同導致的，SOD 對該部位作用速度較慢而電壓監(jiān)測時間不夠長，也可能是這些部位的自由基量很少，受到干預后少量的改變不足以引起兩組電壓值的明顯變化。值得注意的是，SOD 強化奶片組的電壓值均在70 min 左右（干預的45 min）達到電壓峰值，表明機體對SOD 的吸收量在此時達到了最大，對機體產(chǎn)生的作用效果也最強。

4 結論

SOD 強化奶片較奶片具有更高的SOD 活力和還原性。經(jīng)絡電壓監(jiān)測結果顯示：針對肺經(jīng)和膽經(jīng)，SOD 強化奶片有影響作用而奶片沒有；針對大腸經(jīng)、脾經(jīng)、小腸經(jīng)、膀胱經(jīng)、三焦經(jīng)和肝經(jīng)經(jīng)絡電壓，SOD 強化奶片比奶片的影響作用更強；針對胃經(jīng)、心經(jīng)、腎經(jīng)和心包經(jīng)經(jīng)絡電壓，奶片和SOD 強化奶片都有一定的影響作用，且作用相似。以上結果表明，通過測量經(jīng)絡穴位電壓的方法不僅能安全、便捷地反映出攝入食品對人體的作用速度，還為評價食品效能提供全新視角，具有廣闊的應用前景。