國(guó)產(chǎn)頭孢克肟膠囊在健康受試者體內(nèi)的生物等效性研究

隋 鑫，李曉斌，王華偉，曹 瑩，喻 明，陳 璐，王文萍

頭孢克肟（cefixime）是第一個(gè)口服有效的第三代頭孢菌素類抗生素[1]，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌及革蘭陰性菌均有抗菌效果[2]。1999年已在80多個(gè)國(guó)家得到廣泛的臨床應(yīng)用。頭孢克肟的制劑劑型有膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、片劑（普通片劑、咀嚼片、分散片）等。頭孢克肟膠囊的原研公司為日本長(zhǎng)生堂制藥株式會(huì)社，商品名為Cefspan?。石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的頭孢克肟膠囊規(guī)格為0.1 g，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20041669，屬于國(guó)家基本藥物目錄。根據(jù)國(guó)務(wù)院規(guī)定，化學(xué)藥品新注冊(cè)分類實(shí)施前批準(zhǔn)上市的仿制藥，凡未按照與原研藥品質(zhì)量和療效一致原則審批的，均須開(kāi)展一致性評(píng)價(jià)[3]。本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法測(cè)定給藥后不同時(shí)間點(diǎn)頭孢克肟血藥濃度，以評(píng)價(jià)頭孢克肟膠囊國(guó)產(chǎn)制劑與進(jìn)口制劑在中國(guó)健康受試者的生物等效性及安全性，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和研究對(duì)象

1.1.1 藥物與儀器 參比藥物：頭孢克肟膠囊（商品名Cefspan?），規(guī)格0.1 g/粒，批號(hào)BG011，含量102.2%，由日本長(zhǎng)生堂制藥株式會(huì)社生產(chǎn)，由石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司提供。受試制劑：頭孢克肟膠囊（商品名歐?。?，0.1 g/粒，批號(hào)136170998，含量99.3%，由石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)和提供。

頭孢克肟對(duì)照品：HPLC純度99.0%，批號(hào)1250-023A1，TLC公司提供； [13C3，15N2]-頭孢克肟（頭孢克肟?jī)?nèi)標(biāo)物）：HPLC純度 95.22%，核素純度 99%13C, 98.6%15N，批號(hào)ZZS17101801，IsoReag提供。

研究用儀器如下：AB Sciex API 4000 質(zhì)譜儀；島津LC-20ADXR液相色譜系統(tǒng)；Thermo Fisher Heraeus Muitifuge X1R離心機(jī)；Sartorius CPA225D或MSA6.6S-OCE-DM分析天平；Merck Millipore Milli-Q純水儀；ABSciexAnalyst 1.6.3?數(shù)據(jù)采集軟件。

1.1.2 受試者的選擇 本研究由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)承擔(dān)，試驗(yàn)方案經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。受試者簽署知情同意書。按照受試者隨機(jī)號(hào)將健康受試者按照1∶1比例隨機(jī)分配到 2個(gè)給藥程序（受試制劑T-參比制劑R或參比制劑R-受試制劑T）之一。

入選標(biāo)準(zhǔn)：18周歲及以上的健康受試者；體重指數(shù)在19.0～26.0 kg/m2，男性受試者體重≥50.0 kg，女性受試者體重≥45.0 kg。無(wú)心、肝、腎、消化道、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及精神異常，代謝異常等病史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有煙酒嗜好者；有頭孢菌素類、青霉素類抗生素過(guò)敏史、其他藥物或食物過(guò)敏史、過(guò)敏體質(zhì)者；生命體征、體格檢查、心電圖及各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果異常且經(jīng)臨床醫(yī)師判斷有臨床意義；酒精呼氣檢查、尿液藥物篩查呈陽(yáng)性者；乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒抗原（抗體）陽(yáng)性者，HIV陽(yáng)性者；給藥前28 d內(nèi)服用了任何改變肝酶活性的藥物；給藥前14 d內(nèi)服用了任何處方藥、非處方藥、草藥等。

空腹組入組32名健康受試者：其中T-R組有男12名、女4名，平均年齡為（25.3 ± 8.0）歲（19.1～47.8歲），平 均 身 高 為（170.5 ± 8.0）cm（157.5～189.5 cm），平均體重為（62.0 ± 9.1）kg（49.3～86.2 kg），平均體重指數(shù)為（21.3 ± 2.1）kg/m2（19.0～25.0 kg/m2）；R-T組有9名男性受試者、7名女性受試者，平均年齡為（25.7 ± 6.5）歲（19.6～39.6歲），平均身高為（167.0 ± 8.2）cm（157.0～182.0 cm），平均體重為（64.1 ± 9.1）kg（48.6～81.4 kg） ，平 均 體 重 指 數(shù) 為（23.0 ± 2.2）kg/m2（19.0～26.0 kg/m2）。餐 后 組 入 組26名健康受試者：其中T-R組有11名男性受試者、2名女性受試者，平均年齡為（25.3 ± 4.5）歲（21.3～35.0歲），平均身高為（172.2 ± 6.3）cm（158.5～182.0 cm），平均體重為（64.5 ± 5.8）kg（56.6～74.5 kg），平 均 體 重 指 數(shù) 為（21.7 ± 1.3）kg/m2（19.5～23.9 kg/m2）；R-T組 有8名 男性受試者、5名女性受試者，平均年齡為（28.7 ± 10.6）歲（19.4～56.5歲），平均身高為（166.9 ± 10.3）cm（148.5～185.0 cm），平均體重為（62.4 ± 8.7）kg（45.1～75.0 kg），平均體重指數(shù)為（22.3 ± 1.6） kg/m2（19.8～24.8 kg/m2）。

1.2 給藥方案和血樣采集及處理

1.2.1 給藥方案 本試驗(yàn)采用單中心、空腹/餐后、隨機(jī)、開(kāi)放、兩周期、兩交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)?？崭菇M和餐后組分別入組32名和26名受試者，隨機(jī)分為2組，分別口服頭孢克肟膠囊受試制劑和參比制劑0.1 g（1粒），用藥間隔7 d?？崭乖囼?yàn)組受試者每周期給藥當(dāng)天，在空腹10 h后以240 mL常溫水送服相應(yīng)藥物；餐后試驗(yàn)組受試者每周期給藥當(dāng)天給藥前30 min開(kāi)始進(jìn)食高脂餐，并在30 min內(nèi)進(jìn)餐完畢，在開(kāi)始進(jìn)餐后30 min時(shí)準(zhǔn)時(shí)以240 mL常溫水送服相應(yīng)制劑。

1.2.2 血樣采集及處理 每周期給藥0時(shí)（給藥前60 min內(nèi)）和給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、8 h、9 h、10 h、12 h、16 h、24 h采集靜脈血。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集靜脈血約4 mL，至預(yù)冷的EDTA-K2抗凝管中，將采血管上下輕柔顛倒數(shù)次至血樣混勻，置于冰浴中暫放，血樣采集后60 min內(nèi)在預(yù)冷離心機(jī)2～8 ℃條件下，2000 ×g，離心10 min，所有離心后血漿樣品在冰浴上被分為兩份，其中取約 1 mL 血漿加入到待測(cè)管中，其余血漿放入到備份管中。血樣采集2 h內(nèi)將血漿樣品放入超低溫冰箱（≤－60℃）凍存。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件和血漿樣品預(yù)處理

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18（2.1 mm×50 mm，3 μm）；流動(dòng)相：A為含0.05% 乙酸和5.00 mmol/L NH4Ac的水溶液，B為100%甲醇；流速：0.400 mL/min；柱溫：40 °C；梯度洗脫 （0 min，15% B；0.3 min，15% B；0.5 min，50% B；1.8 min，50% B；1.9 min，95% B；3 min，95% B；3.1 min，15% B；4.5 min，15% B）；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：Turbo Spray（ABSciex生產(chǎn)），ESI，正離子模式；掃描方式為MRM；頭孢克肟和內(nèi)標(biāo)[13C3，15N2]-頭孢克肟去集束電壓（DP）分別為68V和70V，碰撞能量（CE）分別為22V和21V；頭孢克肟用于定量分析的離子對(duì)為m/z454.0→m/z285.2，內(nèi)標(biāo)離子對(duì)為m/z459.0→m/z290.1。

1.2.3.3 血漿樣本預(yù)處理 待測(cè)生物樣品室溫融化后，轉(zhuǎn)移至冰浴條件下存放，向96孔板中加入50.0 μL樣品（待測(cè)生物樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品）；對(duì)于雙空白樣品和零點(diǎn)樣品，加入50.0 μL空白人血漿。除雙空白樣品和不含內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品外，向所有樣品中加入50.0 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液（1 000 μg/L）；對(duì)于雙空白樣品和不含內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品中，加 50.0 μL 50%甲醇水溶液。將96孔板充分振搖1 min。向所有樣品中加入200 μL甲醇。將96孔板密封后，充分振搖10 min。將所有樣品在4 ℃條件下以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。將50.0 μL上清液轉(zhuǎn)移到干凈的96孔板中，以200 μL超純水稀釋。將96孔板密封后，充分振搖10 min，放置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，10.0 μL進(jìn)樣分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Phoenix WinNonlin（8.0版）軟件以非房室模型計(jì)算各受試者體內(nèi)頭孢克肟的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。并對(duì)AUC0-t、AUC0-∞和Cmax經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析（ANOVA），然后采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)、計(jì)算90%CI統(tǒng)計(jì)分析方法來(lái)評(píng)價(jià)受試制劑與參比制劑的生物等效性。當(dāng)受試制劑與參比制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均值比的90%CI在80.00%～125.00%區(qū)間內(nèi)，則認(rèn)為兩制劑生物等效。

2 結(jié)果

2.1 受試者入組及完成情況

空腹組隨機(jī)33名受試者，有1名于第一周期給藥前出現(xiàn)不良事件，退出試驗(yàn)；有2名受試者在第二周期給藥前退出試驗(yàn)，未參加第二周期試驗(yàn)，30名受試者均按方案要求完成試驗(yàn)；餐后組入組26名健康受試者，均按方案要求完成試驗(yàn)。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 專屬性 頭孢克肟與其內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間均約為1.24 min，色譜峰峰形良好。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 以待測(cè)物（頭孢克肟）與內(nèi)標(biāo) [13C3，15N2] -頭孢克肟的色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以血漿中待測(cè)物的質(zhì)量濃度（x）與峰面積比（y）進(jìn)行線性回歸，頭孢克肟血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度為20、40、150、500、1 500、2 500、3 200 μg/L，所得頭孢克肟回歸方程為y=0.001 313x+0.0 003 263（r2=0.998 1）。結(jié)果表明頭孢克肟血藥濃度在20～3 200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系好，其定量下限為20 μg/L。

2.2.3 精密度與準(zhǔn)確度 制備定量下限濃度水平和低、中、高3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品（頭孢克肟的質(zhì)量濃度為20、50、800、2 400 μg/L），每濃度取6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，結(jié)果表明低、中、高3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果的批內(nèi)和批間精密度均≤4.2%，定量下限濃度水平的質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果的批內(nèi)和批間精密度均小于≤6.4%。除定量下限濃度水平外的質(zhì)控樣品的批內(nèi)檢測(cè)準(zhǔn)確度偏差為－3.3%～3.6%，定量下限濃度水平的質(zhì)控樣品的批內(nèi)檢測(cè)準(zhǔn)確度偏差為8.5%～10.0%，除定量下限濃度水平外的質(zhì)控樣品的批間檢測(cè)準(zhǔn)確度偏差為－1.7%～1.0%，定量下限濃度水平的質(zhì)控樣品的批間檢測(cè)準(zhǔn)確度偏差為9.5%。表明各質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度良好。

2.2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的提取回收率分別為91.6%、91.1%、93.9%，內(nèi)標(biāo)[13C3，15N2]-頭孢克肟的提取回收率為92.7%，血樣中頭孢克肟和內(nèi)標(biāo)提取回收率均較高和穩(wěn)定。6個(gè)不同來(lái)源的單個(gè)基質(zhì)中，頭孢克肟低、中、高濃度水平下，內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子均值為97.1%～101.2%，精密度≤2.5%；3個(gè)濃度水平內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子總平均值為99.1%，精密度為2.1%，符合基質(zhì)效應(yīng)考察的要求。

表1 頭孢克肟在血漿中的精密度和準(zhǔn)確度Table 1 Accuracy and precision of cefixime concentration in plasma

2.2.5 穩(wěn)定性 頭孢克肟血漿樣品室溫/冰浴下放置15.5 h、－20 ℃/－70 ℃條件下5次凍融循環(huán)、 －20 ℃條件下長(zhǎng)期冰凍7 d 1 h、－70℃條件下長(zhǎng)期冰凍26 d、69 d；血漿樣品處理后的上清液在 8 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中（處理后樣品穩(wěn)定性）放置4 d 4 h、血漿樣品處理后的上清液稀釋液在8 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中（進(jìn)樣重現(xiàn)性）放置4 d 3 h和7 d 9 h，以上條件下穩(wěn)定性均良好。

2.3 平均血藥濃度-時(shí)間曲線

空腹和餐后試驗(yàn)中受試者服藥后頭孢克肟血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 空腹組受試者服用受試制劑(T)與參比制劑(R)后血漿中頭孢克肟平均血藥濃度-時(shí)間曲線Figure 1 Mean plasma concentration-time curve of test (T) and reference (R) cefixime after single dose of cefixime capsule under fasted condition

圖2 餐后組受試者服用受試制劑(T)與參比制劑(R)后血漿中頭孢克肟平均血藥濃度-時(shí)間曲線Figure 2 Mean plasma concentration - time curve of test (T) and reference (R) cefixime after single dose of cefixime capsule under fed condition

2.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

空腹試驗(yàn)有30名健康受試者口服受試制劑和32名健康受試者口服參比制劑，有2名受試者在第二周期入住日退出試驗(yàn)，而未進(jìn)入藥動(dòng)學(xué)分析集（PKS）。餐后試驗(yàn)組26名受試者全部納入藥動(dòng)學(xué)參數(shù)集分析。受試者空腹和餐后單次口服受試制劑和參比制劑后血漿中頭孢克肟的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 空腹和餐后試驗(yàn)頭孢克肟主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 2 The main pharmacokinetic parameters of cefixime under fasted and fed conditions

2.5 生物等效性評(píng)價(jià)

表3中數(shù)據(jù)結(jié)果表明，經(jīng)雙單側(cè)t檢驗(yàn)分析后，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的幾何均數(shù)比值（受試制劑/參比制劑）的90%CI結(jié)果均在可接受等效范圍（80.00%～125.00%）內(nèi)，P值均＜0.05，即本試驗(yàn)兩制劑在空腹給藥條件下和餐后給藥條件下均具有生物等效性。

表3 頭孢克肟膠囊生物等效性結(jié)果Table 3 Bioequivalence of test cefixime capsules compared to reference cefixime capsules

2.6 安全性評(píng)價(jià)

空腹試驗(yàn)過(guò)程中30名受試者服用受試制劑，有4名受試者發(fā)生5例次不良事件，其中1名受試者發(fā)生2次不良反應(yīng)，分別為血白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低1次和血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)降低1次，有1名受試者失訪。32名受試者服用參比制劑，有7名受試者發(fā)生10例次不良事件，其中2名受試者發(fā)生4例次不良反應(yīng)，分別為白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低2例次和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)降低2例次，有2名受試者失訪。除1名受試者的1次不良事件嚴(yán)重程度為中度，其余不良事件均為輕度。2名受試者因不良事件退出。

餐后試驗(yàn)所有26名受試者用藥后均完成安全性觀察，受試制劑有6名受試者發(fā)生8例次不良事件，其中3名受試者發(fā)生5例次不良反應(yīng)，分別為白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低3次和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)降低2次，有1名受試者失訪。參比制劑有3名受試者發(fā)生4例次不良事件，其中2名受試者發(fā)生3例次不良反應(yīng)，分別為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高1次、白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低1次和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)降低1次，有2名受試者失訪。受試者的不良事件的嚴(yán)重程度均為輕度。兩組均無(wú)嚴(yán)重不良事件發(fā)生。試驗(yàn)期間發(fā)生的不良事件已按照該方案的要求及標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行了申報(bào)和處理。表明受試制劑和參比制劑的安全性和耐受性良好。

3 討論

本分析方法采用穩(wěn)定核素標(biāo)記的[13C3，15N2]-頭孢克肟作為內(nèi)標(biāo)，[13C3，15N2]-頭孢克肟與待測(cè)物頭孢克肟有相同的理化性質(zhì)，兩者保留行為和離子化行為一致，可以避免基質(zhì)效應(yīng)、回收率等導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不可靠的情況出現(xiàn)。HPLC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，空腹試驗(yàn)頭孢克肟受試制劑與參比制劑的達(dá)峰時(shí)間分別為（4.45±0.65）h和（4.64±0.86）h，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4-5]；餐后試驗(yàn)頭孢克肟受試制劑與參比制劑的達(dá)峰時(shí)間分別為（5.33±1.13）h和（5.75 ±1.01）h，結(jié)合本試驗(yàn)獲得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，提示進(jìn)食高脂餐可能會(huì)導(dǎo)致頭孢克肟達(dá)峰時(shí)間延遲、吸收減少。

本研究受試制劑和參比制劑的各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均非常接近，兩種制劑的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)相似，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的 幾 何 均 值 比 值 的90%CI皆 在80.00%～125.00%，表明本試驗(yàn)受試制劑與參比制劑生物等效。安全性數(shù)據(jù)表明，中國(guó)健康受試者單次空腹和餐后服用0.1 g頭孢克肟膠囊安全性良好。綜上所述，中國(guó)健康志愿者空腹和餐后狀態(tài)下口服0.1 g頭孢克肟膠囊受試制劑與參比制劑具有生物等效性，受試制劑與參比制劑安全性和耐受性均良好。