藏香豬血液中抗氧化肽的提取

張 震，楊朋坤，鄭 鳴，王永芬

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046； 3.河南省畜禽生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

藏香豬是我國青藏高原的一種獨(dú)特的本土豬種，生長在平均海拔超過3000米的惡劣自然環(huán)境中。藏香豬具有耐粗飼料、抗病、肉質(zhì)性能優(yōu)良等特點(diǎn)，尤其具有較強(qiáng)的高原氣候適應(yīng)性。對藏香豬血液的生理生化分析顯示，其血液具有比長白豬更強(qiáng)的低氧適應(yīng)能力、抗氧化應(yīng)激能力以及高的肌肉活動量，這與其生長環(huán)境密切相關(guān)[1]。因此，從藏香豬血液中提取高活性的天然抗氧化肽對提升藏香豬的綜合利用價(jià)值具有重要意義。

生物體進(jìn)化出了與其生長環(huán)境高度匹配的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，正常需氧生物體內(nèi)的活性氧(如羥基自由基、單線態(tài)氧、超氧陰離子和過氧化氫)均可通過酶促(谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氬酶和超氧化物歧化酶)反應(yīng)和非酶促(谷胱甘肽、生育酚、抗氧化劑)反應(yīng)被有效中和[2,3]。在病理或極端環(huán)境條件下，細(xì)胞的天然抗氧化防御能力易被破壞，經(jīng)常產(chǎn)生過量的活性氧自由基(Realtive Oxygen Species,ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞關(guān)鍵生物聚合物(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸)的氧化損傷。這些生物大分子的持續(xù)氧化損傷與癌癥、心血管疾病、阿爾茨海默氏癥等慢性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[4，5]。藏香豬作為長期在高原低氧環(huán)境中生存的生物，其體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)也相應(yīng)地與低氧環(huán)境相適應(yīng)，可以較強(qiáng)清除過量的ROS，保證物種的正常生存和繁衍[6]。

現(xiàn)有的抗氧化肽一部分是天然存在的，如鵝肌肽和谷胱甘肽等，但絕大多數(shù)是通過蛋白質(zhì)的酶解、發(fā)酵、模擬胃腸道消化、食品加工或化學(xué)合成獲得的[5]。食品源的多肽在胃腸道消化后產(chǎn)生的新肽可以使其抗氧化活性增加[7]。食品蛋白酶水解產(chǎn)生的抗氧化肽通常是高效、安全和廉價(jià)的。溫度、酸堿度、壓力、反應(yīng)時(shí)間等水解條件以及酶底物比和水解度等因素都會影響食品蛋白酶衍生肽的化學(xué)性質(zhì)。近年來，已經(jīng)從紅藻掌狀藻[8]、加工魚洗滌水[9]、雞血細(xì)胞[10]、魷魚殼聚糖、鮑魚內(nèi)臟、牡蠣珍珠、米糠[11]、桑葉和桑蠶等多種不可食用或非傳統(tǒng)食物中通過酶水解等方法獲取抗氧化肽[5]。藏香豬富含獨(dú)特抗氧化性能材料，目前只有少量文獻(xiàn)報(bào)道其抗氧化肽的提取方法。

本研究以高原生存的藏香豬血液為原料，通過對復(fù)合酶種類、配比、酶解時(shí)間等因素進(jìn)行研究，建立了一種超聲波輔助酶解聯(lián)合凝膠層析法從藏香豬血液中高效提取抗氧化肽，為藏香豬血液的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藏香豬血液由西藏農(nóng)牧科學(xué)院提供，長白豬血液由中牟縣豬場提供。胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和DHHP清除檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，血液蛋白快速提取試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，其他常用化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬血總蛋白的提取

取藏香豬抗凝血，利用血液蛋白快速提取試劑盒提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 豬血總蛋白的酶解

100 mL總蛋白中分別添加50 U胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K或復(fù)合酶，37 ℃ 孵育12 h，每隔1 h取樣一次，使用鄰苯二甲醛法檢測總蛋白的水解度。

1.2.3 超聲波輔助總蛋白的酶解

酶解反應(yīng)時(shí)，對酶解產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行超聲波處理，在超聲波功率0～900 W，超聲波頻率0～35 Hz，超聲開5 s停5 s的條件下，復(fù)合酶酶活50 U/100 mL的反應(yīng)體系中，超聲波輔助處理0～15 min，然后37 ℃ 孵育4 h。檢測不同的超聲波處理時(shí)間、超聲功率和超聲頻率對酶解產(chǎn)物水解度的影響。使用鄰苯二甲醛法檢測總蛋白的水解度。

1.2.4 酶解產(chǎn)物的分級分離及清除率檢測

將最終的酶解產(chǎn)物分別用1000 Da，5000 Da、10000 Da的超濾管進(jìn)行離心過濾，分別得到<1000 Da，1000～5000 Da，5000～10000 Da和>10000 Da的酶解產(chǎn)物，用DHHP清除能力檢測試劑盒，檢測不同分子量大小的酶解產(chǎn)物DHHP自由基清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏香豬血液總蛋白的提取

使用血液總蛋白提取試劑盒提取長白豬和藏香豬血液總蛋白，并使用考馬斯亮藍(lán)法以及紫外-可見分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果顯示，使用試劑盒提取的藏香豬和長白豬血液總蛋白濃度分別為7.9 g/100 mL和8.1 g/100 mL，差異不顯著(P>0.05)。A260/280分別為0.57和0.54，蛋白質(zhì)純度較高，可用于下一步酶解實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同酶酶解豬血總蛋白的效果

由于蛋白酶的位點(diǎn)特異性，不同酶酶解同一底物的產(chǎn)物是不同的，因此產(chǎn)物的水解度和抗氧化性也有所差異。為了檢驗(yàn)不同蛋白酶酶解豬血蛋白產(chǎn)物的水解度和抗氧化性能，分別用50 U/100 mL 工作濃度的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K或胰蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰凝乳蛋白酶(1∶1∶1)復(fù)合酶酶解藏香豬血液總蛋白。鄰苯二甲醛法檢測總蛋白的水解度，用DHHP清除能力檢測試劑盒檢測其抗氧化能力。

結(jié)果顯示，單獨(dú)的胰蛋白酶酶解藏香豬血液總蛋白8 h，水解度達(dá)到最大(16.1%左右)(圖1A)，木瓜蛋白酶酶解9 h水解度達(dá)到最大(10.4%左右)(圖1B)、胰凝乳蛋白酶酶解11 h水解度達(dá)到最大(9.6%左右)(圖1C)，蛋白酶K酶解藏香豬血液酶解4 h水解度達(dá)到最大(52.1%左右)(圖1D)。復(fù)合酶可以實(shí)現(xiàn)對藏香豬總蛋白的快速酶解，酶解反應(yīng)6 h即可達(dá)到最大水解度(23.6%左右)(圖1E)。

圖1 不同酶酶解藏香豬血液總蛋白產(chǎn)物的水解度

對不同蛋白酶酶解藏香豬血液總蛋白的產(chǎn)物進(jìn)行DHHP清除能力測試顯示，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解產(chǎn)物對DHHP清除率在40%左右，蛋白酶K酶解產(chǎn)物對DHHP清除率在20%左右。復(fù)合酶酶解產(chǎn)物的抗氧化性能明顯優(yōu)于單獨(dú)酶解產(chǎn)物，DHHP清除能力可達(dá)63.4%以上，是單獨(dú)酶酶解產(chǎn)物DHHP清除能力的1.5倍以上(圖2)。

圖2 不同蛋白酶酶解藏香豬血液總蛋白產(chǎn)物對DHHP清除率

2.3 超聲波輔助總蛋白酶解效果分析

血液總蛋白的含量較高、粘度較大，使用直接酶解法通常需用較長時(shí)間才能達(dá)到最大水解度。超聲波處理有助于降低蛋白的粘度，增加酶與底物的接觸，因此超聲波輔助通常認(rèn)為有助于蛋白質(zhì)的酶解。為了探究超聲波輔助處理對藏香豬血液酶解效果的影響，本研究檢測了超聲波處理時(shí)間、超聲波功率、超聲波頻率對酶解效率的影響。

結(jié)果顯示，超聲功率300 W，超聲頻率20 Hz的條件下，超聲時(shí)間9 min 最有利于總蛋白的酶解，酶解產(chǎn)物的水解度可以提升15%，達(dá)到23.4%左右(圖3A)。超聲時(shí)間9 min，超聲波功率300 W的條件下，超聲波頻率25 Hz最有利于蛋白質(zhì)的酶解，最大水解度可達(dá)26.4%(圖3B)。超聲時(shí)間 9 min，超聲波頻率25 Hz的條件下，500 W的超聲波功率最有利于蛋白質(zhì)的酶解，最大水解度可達(dá)28.5%(圖3C)。同時(shí)檢測的DHHP清除率顯示超聲波輔助酶解9 min，超聲功率500 W，超聲波頻率25 Hz時(shí)蛋白酶解產(chǎn)物的DHHP清除率最高(圖3D-F)。

圖3 不同超聲波處理因素對藏香豬總蛋白酶解產(chǎn)物的水解度和DHHP清除率的影響

使用工作濃度為50 U/100 mL的復(fù)合酶分別酶解長白豬和藏香豬血液總蛋白，在超聲波功率500 W，超聲波頻率25 Hz，超聲開5 s停5 s的條件下，超聲波處理9 min，然后37 ℃ 孵育4 h。檢測長白豬和藏香豬豬血酶解產(chǎn)物的水解度和DHHP清除率。

結(jié)果顯示，藏香豬和長白豬血液酶解產(chǎn)物水解度分別為28.5%和29.1%，差異不顯著(P>0.5)。藏香豬和長白豬血液酶解產(chǎn)物對DHHP清除率分別為71.3%和52.6%，藏香豬血液酶解產(chǎn)物的抗氧化性能明顯優(yōu)于長白豬(圖4)。

圖4 最優(yōu)處理?xiàng)l件下長白豬和藏香豬血液酶解產(chǎn)物的水解度和DHHP清除率

2.4 酶解產(chǎn)物的分級分離

超聲波輔助藏香豬血液蛋白酶解產(chǎn)物成分比較復(fù)雜，不利于后期的應(yīng)用，使用超濾管收集分子量不同的蛋白組分，對其蛋白含量和對DHHP清除率進(jìn)行檢測。

結(jié)果顯示，藏香豬血液酶解產(chǎn)物中具有抗氧化活性的部分主要集中于<1 KDa的肽段中，其對DHHP的清除率可達(dá)80%左右，隨著分子量的增大，其酶解產(chǎn)物對DHHP清除率急劇降低，>10 KDa 的蛋白質(zhì)組分對DHHP的清除率不足10%。對藏香豬和長白豬血液的酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行超濾分離，發(fā)現(xiàn)藏香豬血液的酶解產(chǎn)物中的小分子蛋白濃度高于長白豬，其DHHP清除率比長白豬高20%左右(圖5)。

圖5 不同分子量大小酶解產(chǎn)物的DHHP清除率

本研究說明使用超聲波輔助復(fù)合酶酶解法可以有效酶解豬血總蛋白，豬血酶解產(chǎn)物的主要抗氧化肽存在于小分子多態(tài)中，藏香豬的血液酶解產(chǎn)物的抗氧化性能優(yōu)于普通長白豬。

3 討論

豬血是豬肉屠宰加工行業(yè)的副產(chǎn)品，我國作為豬產(chǎn)品使用大國，豬血資源非常豐富，但是對豬血的綜合利用多是粗放型的，對豬血中大量的高附價(jià)值產(chǎn)品的精制和純化不足，豬血資源未完全開發(fā)?？寡趸氖秦i在生長過程中形成的對抗體內(nèi)氧自由基損傷的天然產(chǎn)物。目前，雖有多篇文獻(xiàn)報(bào)道使用酶解、菌酶發(fā)酵、酸水解等方法從豬血中提取抗氧化肽，但其使用的豬血多來源于普通商品豬，對特殊環(huán)境生存豬的血液研究較少。

藏香豬長期生存在高原環(huán)境中，高寒、高海拔、氧分壓低的高原環(huán)境特點(diǎn)使藏香豬進(jìn)化出了與之適應(yīng)的生理性能。藏香豬血液中的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶含量顯著高于長白豬[1]。這說明藏香豬比長白豬具有更強(qiáng)的低氧適應(yīng)能力、抗氧化應(yīng)激能力以及高的肌肉活動量，而且藏豬生長的海拔越高，其抗氧化能力越強(qiáng)。從藏香豬中提取的抗氧化肽可能會比普通豬血中提取的抗氧化肽具有更好的抗氧化性，這也為藏香豬血液中抗氧化肽的提取提供了理論依據(jù)。

本研究所用超聲波輔助復(fù)合酶酶解豬血總蛋白，并進(jìn)行超濾分離獲取高活性抗氧化肽的方法，可以快速有效地獲取具有較高DHHP清除率和總抗氧化活性的抗氧化肽。通常認(rèn)為，蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的還原能力隨著水解度的增加而增加，多肽暴露出的含親核含硫氨基酸殘基(Cys和Met)、芳香族氨基酸殘基(Phe、Trp和Tyr)和含咪唑環(huán)的組氨酸殘基越多，其還原力越強(qiáng)[12,13]。但是本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶水解蛋白后如果肽段過短，其DHHP清除率反而會降低。說明抗氧化肽維持其還原力，除了需要部分氨基酸的作用外，還需要維持一定的空間構(gòu)象。蛋白酶K對總蛋白的水解度達(dá)到50%以上，造成多肽鏈極短，甚至部分變成游離氨基酸，因此其DHHP清除能力變低。木瓜蛋白酶的特異性較強(qiáng)，單獨(dú)酶解總蛋白的產(chǎn)物分子量較大，活性氨基酸位點(diǎn)暴露不足，因此還原力較弱。復(fù)合酶具有較多的特異性酶解位點(diǎn)，可以充分地暴露具有抗氧化能力的活性氨基酸殘基，使其還原力提升。下一步可以使用酶解位點(diǎn)位于活性氨基酸殘基周邊的蛋白酶對總蛋白進(jìn)行水解，使Cys、Phe等活性氨基酸殘基暴露更充分，從而提升酶解產(chǎn)物的還原力。

從豬血中提取的總蛋白通常粘度較高，不利于酶解反應(yīng)的發(fā)生，超聲波處理是常用輔助酶解的手段[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用短時(shí)間中等功率的低頻超聲波處理有利于蛋白的水解，有利于抗氧化肽還原力的提升。這可能是由于過長時(shí)間的超聲處理會使溫度升高，蛋白變性，不利于蛋白的水解和還原力的保持。中等功率的低頻超聲波還能使蛋白質(zhì)和酶的接觸更為充分，可以降低溶液粘度，促進(jìn)酶促反應(yīng)的發(fā)生。因此使用超聲波處理不僅使酶解反應(yīng)更充分，還可以加速反應(yīng)的發(fā)生，使整體的處理時(shí)間降低，有助于整體技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。

經(jīng)過酶解的產(chǎn)物實(shí)際上是一個(gè)富含各種無還原力蛋白、蛋白酶、小分子物質(zhì)和其他物質(zhì)的混合物，其性質(zhì)不穩(wěn)定，總還原力雖高，但是體積較大，不利于下一步利用。采用超濾的方法將酶解產(chǎn)物根據(jù)分子量的不同進(jìn)行分級分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 KDa以下的酶解產(chǎn)物對DHHP清除率最高，下一步可將制得的還原力較高的蛋白加入保護(hù)劑后制成凍干粉，得到性質(zhì)穩(wěn)定的抗氧化肽。

本研究以長白豬為對照，優(yōu)化藏香豬抗氧化肽的提取工藝，發(fā)現(xiàn)藏香豬血液總蛋白和長白豬血液總蛋白的含量差異不顯著，酶解產(chǎn)物的水解度大致相當(dāng)，說明二者總蛋白的氨基酸組成差異不顯著，特別是本文所使用三種酶識別位點(diǎn)的差異不顯著。但是二者DHHP清除能力有顯著差異，可能是藏香豬在長期的高原生活中，為了適應(yīng)高原高寒、低氧的環(huán)境特點(diǎn)，特殊的蛋白位點(diǎn)發(fā)生了變異，自身的抗氧化性能得到較大的提升，因此水解得到的抗氧化肽活性也較高。對獲得高活性抗氧化肽的性質(zhì)研究，如抗氧化肽對低氧的適應(yīng)性、對溫度和對酸堿的耐受性研究將是我們下一步的工作重點(diǎn)。