2種全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)抗苗勒管激素評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力的比較

馮奕習(xí)，彭偉如，陳丹華，李漢秋，陳見輝，陳小冰

(東莞市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 東莞 523000)

抗苗勒管激素(AMH)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的一種多肽分子，由卵巢的前竇顆粒細(xì)胞和卵泡分泌，是目前預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備的最佳生物標(biāo)志物[1]。AMH在調(diào)節(jié)原始卵泡募集和卵泡生長(zhǎng)中起著重要作用[2-3]。AMH可抑制卵泡刺激素(FSH)的作用，導(dǎo)致排卵障礙，從而使卵泡持續(xù)生長(zhǎng)；AMH也可下調(diào)顆粒細(xì)胞的芳香化能力，減少雌二醇(E2)的產(chǎn)生，直到卵泡達(dá)到8 mm時(shí)AMH含量迅速降低至無(wú)法檢測(cè)到，而E2濃度迅速上升[1-3]。因此，AMH測(cè)定值與FSH和E2密切相關(guān)。有文獻(xiàn)[1]報(bào)道高水平的AMH與卵巢癌和多囊卵巢密切相關(guān)，但在絕經(jīng)后女性的血液中卻檢測(cè)不到。目前AMH在生殖醫(yī)學(xué)中常用于評(píng)估卵巢儲(chǔ)備和預(yù)測(cè)體外受精(IVF)前藥物刺激后的卵巢反應(yīng)[4-5]。因此，血清AMH含量的檢測(cè)在IVF用藥的臨床決策、個(gè)體化咨詢以及其他相關(guān)的臨床應(yīng)用中具有較好的指導(dǎo)意義。

AMH檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和電化學(xué)發(fā)光法等，其中亞輝龍公司和貝克曼公司的AMH檢測(cè)平臺(tái)采用的化學(xué)發(fā)光法，靈敏度和自動(dòng)化程度高，報(bào)告穩(wěn)定，適合臨床大樣本的檢測(cè)。本研究分別使用貝克曼UniCel DxI 800和亞輝龍iFlash3000 2種檢測(cè)平臺(tái)對(duì)125例女性血液樣本進(jìn)行AMH濃度檢測(cè)，評(píng)估2種平臺(tái)在卵巢儲(chǔ)備功能中的作用，為相關(guān)臨床疾病的診斷和輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀：iFlash 3000(深圳亞輝龍，中國(guó))和UniCel DxI 800(貝克曼庫(kù)爾特公司，美國(guó))。試劑盒為iFlash AMH和Access AMH，檢測(cè)范圍分別為：0.01～16.0 ng·mL-1和0.02～23.7 ng·mL-1，檢測(cè)下限分別為0.01和0.02 ng·mL-1。所有的檢測(cè)程序均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，使用各自廠家提供的質(zhì)控品進(jìn)行日常的質(zhì)控。

1.2 一般資料

選取2020年5—7月東莞市中醫(yī)院婦科門診就診的125例女性患者，于月經(jīng)周期第2—4天抽血進(jìn)行AMH濃度檢測(cè)，同時(shí)行陰道超聲檢測(cè)確定患者卵泡數(shù)。根據(jù)血清AMH檢測(cè)平臺(tái)的不同分為亞輝龍組和貝克曼組。另參照文獻(xiàn)[6-7]根據(jù)卵泡數(shù)評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力，并以卵巢儲(chǔ)備功能不同將125例患者分為5個(gè)亞組，即亞組1(圍絕經(jīng)期組)12例，年齡為50～60歲，平均年齡(49.92±3.50)歲，其卵泡數(shù)(AFC)為0；亞組2(卵巢低反應(yīng)組)20例，年齡為(39.75±3.78歲)，其AFC為0～7個(gè)；亞組3(卵巢功能正常組)17例，年齡為(33.18±3.54)歲，其AFC為8～15個(gè)；亞組4(卵巢高反應(yīng)組)19例，年齡為(28.42±2.69)歲，其AFC為16～23個(gè)和亞組5(多囊卵巢綜合征，PCOS組)57例，年齡為(30.04±3.46)歲，其AFC>24個(gè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

基于美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)EP文件的標(biāo)準(zhǔn)要求[8]，根據(jù)2個(gè)檢測(cè)平臺(tái)試劑盒檢測(cè)的線性范圍，選取已知的AMH高、中、低濃度3個(gè)水平的血清標(biāo)本各1份，在亞輝龍和貝克曼儀器重復(fù)檢測(cè)20次，用于批內(nèi)精密度分析；每份標(biāo)本每天測(cè)定1次，持續(xù)20 d，用于批間精密度分析。125例血清樣本分別在2個(gè)平臺(tái)上，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)AMH濃度后進(jìn)行一致性相關(guān)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用MedCalc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用受試者工作特征曲線(ROC)對(duì)AMH評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力進(jìn)行比較。使用Bland-Altman、Passing-Bablok回歸和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較2個(gè)檢測(cè)平臺(tái)測(cè)量值的均差值、測(cè)量值的相關(guān)性以及配對(duì)樣本的差值差異[9]。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證

批內(nèi)和批間精密度分析結(jié)果顯示，2種全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法平臺(tái)測(cè)定AMH水平均具有良好的精密度：低、中、高3個(gè)濃度樣品的貝克曼測(cè)定值批內(nèi)變異系數(shù)(CV)分別為2.08%、1.42%和1.34%，批間CV分別為 3.40%、2.35%和2.05%；亞輝龍測(cè)定值批內(nèi)CV分別為1.77%、1.06%和1.08%，批間CV分別為2.63%、2.16%和1.91%。見表1。

表1 2組精密度分析的比較 ng·mL-1

2.2 AMH評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力

2種平臺(tái)檢測(cè)AMH濃度結(jié)果顯示，2組AMH濃度測(cè)定值在卵巢儲(chǔ)備能力上比較一致，表現(xiàn)為隨著卵泡數(shù)的增加，AMH濃度呈增加趨勢(shì)，圍絕經(jīng)期組最低，PCOS組最高。見表2。

表2 2組測(cè)定AMH評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力的比較

表2 2組測(cè)定AMH評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力的比較

組別nAMH亞輝龍亞組1120.078±0.111亞組2200.691±0.579亞組3173.062±1.629亞組4195.123±1.230亞組55712.635±3.356貝克曼亞組1120.047±0.051亞組2200.462±0.529亞組3172.717±1.777亞組4194.591±1.455亞組55715.825±5.402

2.3 AMH對(duì)卵巢儲(chǔ)備能力評(píng)估價(jià)值的測(cè)定

與貝克曼組比較，亞輝龍組區(qū)分卵巢儲(chǔ)備能力較好。在區(qū)分圍絕經(jīng)期組與卵巢低反應(yīng)組、卵巢低反應(yīng)組與卵巢功能正常組、卵巢功能正常與卵巢高反應(yīng)組、卵巢高反應(yīng)組與PCOS組上，亞輝龍檢測(cè)平臺(tái)測(cè)定AMH的截?cái)嘀捣謩e為0.095、0.665、2.130和5.345 ng·mL-1，曲線下面積(AUC)分別為0.965、0.956、0.947和0.910，貝克曼組的截?cái)嘀捣謩e為0.085、0.776、2.365和6.090 ng·mL-1，AUC分別為0.992、0.956和0.960。見表3。2個(gè)平臺(tái)測(cè)定AMH濃度區(qū)分卵巢高反應(yīng)組和PCOS組樣本的ROC曲線圖。見圖1。

表3 2組測(cè)定AMH對(duì)卵巢儲(chǔ)備能力評(píng)估價(jià)值的比較

1-特異度

2.4 AMH檢測(cè)一致性的相關(guān)分析

一致性相關(guān)分析結(jié)果顯示，2組檢測(cè)AMH具有良好的相關(guān)性，一致性相關(guān)系數(shù)ρc=0.849，95%CI=0.803～0.885，相關(guān)系數(shù)ρ為0.903，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.934。Passing-Bablok回歸結(jié)果顯示，y軸亞輝龍數(shù)據(jù)的截距為0.343(95%CI=0.284～0.559)，斜率為0.786(95%CI=0.761～0.836)。見圖2。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)顯示貝克曼和亞輝龍系統(tǒng)檢測(cè)值存在顯著的差異(Z=-2.40，P=0.016)。根據(jù)Bland-Altman圖，兩者的平均值偏差為1.3 ng·mL-1，其差異主要在0線值以下，貝克曼檢測(cè)約比亞輝龍產(chǎn)生的數(shù)據(jù)高0.10倍。見圖3和圖4。

貝克曼/(ng·mL-1)

AMH測(cè)定均值/(ng·mL-1)

AMH均值/(ng·mL-1)

3 討論

AMH Gen II ELISA是檢測(cè)AMH的經(jīng)典試劑盒，使用了兩對(duì)可識(shí)別表位的高度特異性單克隆抗體F2B/7A和F2B/12H，其檢測(cè)下限為0.08 ng·mL-1[10]。新上市的貝克曼Access AMH檢測(cè)試劑盒，抗體與上述試劑盒一致，但由于采用了化學(xué)發(fā)光法，使得其穩(wěn)定性、檢測(cè)靈敏度大大提高[11]。 亞輝龍 AMH免疫測(cè)定的核心技術(shù)是一步式夾心免疫測(cè)定法，使用順磁微粒包被AMH抗體，吖啶標(biāo)記的AMH抗體結(jié)合物，形成夾心(抗體-抗原-抗體)復(fù)合物，該抗體與Access AMH檢測(cè)試劑盒使用的抗體不一致[12]。盡管核心抗體不一致，但2種自動(dòng)化檢測(cè)平臺(tái)測(cè)定AMH均具有出色的批內(nèi)和批間精密度，其CV均低于3%，低于制造商規(guī)定的限值。表明樣本檢測(cè)的一致性較高，無(wú)需重復(fù)測(cè)定。最近的報(bào)道[12-13]表明，使用2種自動(dòng)化方法測(cè)定AMH時(shí)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和實(shí)驗(yàn)室外部的檢測(cè)值之間無(wú)顯著性變化，表明檢測(cè)平臺(tái)較穩(wěn)定。故本研究和前人研究結(jié)果均表明，對(duì)設(shè)備和測(cè)試方法的分析性能驗(yàn)證結(jié)果顯示2種檢測(cè)平臺(tái)的測(cè)試結(jié)果可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部互認(rèn)。

本研究采用亞輝龍和貝克曼2個(gè)檢測(cè)平臺(tái)測(cè)定AMH值用于評(píng)估研究對(duì)象的卵巢儲(chǔ)備能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)定的AMH濃度與卵泡數(shù)高度相關(guān)，與ANDERSON研究[14]結(jié)果一致。該研究使用羅氏AMH測(cè)定試劑盒對(duì)AMH測(cè)定值評(píng)估生長(zhǎng)卵泡池的價(jià)值進(jìn)行了前瞻性研究，研究結(jié)果表明AMH濃度與AFC數(shù)量具有良好的相關(guān)性。本研究結(jié)果還顯示，采用2種平臺(tái)區(qū)分卵巢低反應(yīng)、功能正常和高反應(yīng)、以及圍絕經(jīng)期組和PCOS組的靈敏度和特異度均接近或超過(guò)90%，診斷的AUC均大于0.90，表明采用2個(gè)平臺(tái)檢測(cè)的AMH值均可以預(yù)測(cè)女性的卵巢儲(chǔ)備功能，這與此前的使用貝克曼和羅氏化學(xué)發(fā)光法測(cè)定AMH用于預(yù)測(cè)PCOS的研究結(jié)果相似[15]，表明2個(gè)檢測(cè)平臺(tái)測(cè)定AMH的能力較好。

CLSI EP09-A2文件規(guī)定[9]，為確保項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的一致性，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部需要對(duì)不同儀器檢測(cè)同一項(xiàng)目進(jìn)行比對(duì)，若使用不同平臺(tái)檢測(cè)同一個(gè)項(xiàng)目并發(fā)放報(bào)告時(shí)，檢測(cè)報(bào)告中除了列舉檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果外，理應(yīng)報(bào)告使用的測(cè)定方法和儀器的特定名稱。因此，為了滿足實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部?jī)x器性能的一致性，本研究對(duì)亞輝龍與貝克曼2種測(cè)定方法進(jìn)行比較，相關(guān)性和偏差性分析結(jié)果表明2種方法之間的偏差僅為1.3 ng·mL-1，貝克曼測(cè)定AMH的均值比亞輝龍平臺(tái)檢測(cè)的AMH均值平均高0.1倍，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.934，表明此2種平臺(tái)較為吻合。上述研究結(jié)果表明在2個(gè)檢測(cè)平臺(tái)上AMH的測(cè)定存在均差值比例差異。故實(shí)驗(yàn)室技師和臨床醫(yī)師均應(yīng)該意識(shí)到使用上述2個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定的一些局限性和差異性。

綜上所述，本研究在亞輝龍和貝克曼2個(gè)自動(dòng)化平臺(tái)檢測(cè)了125例臨床樣本的AMH濃度值，所測(cè)定的AMH濃度值均具有良好的預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能的能力，與AFC數(shù)量預(yù)測(cè)的卵巢儲(chǔ)備結(jié)果具有高度相關(guān)性，提示可用于生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。